생화학분자생물학회

연구배경

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  세포 성장 및 암 발생에 기여하는 PI3K/AKT 신호전달은 다양한 암 종에서 활성화 되어 있어, 암 치료의 주요한 표적 신호기전으로 연구되고 있다 (1). PI3K/AKT 신호전달의 길항물질인 PTEN(Phosphatase and Tensin Homologue)은 Phosphatidylinositol-3,4,5-Trisphosphate(PIP3)를 Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate(PIP2)로 탈인산화시켜 PI3K/AKT의 활성화를 저해하는 역할을 하고, 결과적으로 PI3K/AKT 신호전달을 통한 암 발생 및 성장에 주요한 억제 단백질로 작용한다 (2, 3). 암 억제 단백질로서 PTEN의 중요성은 Cowden Syndrome, Bannayan–Zonana Syndrome, Lhermitte–Duclos Disease 같은 유전성 암 질환에서의 돌연변이, 다양한 암 환자 조직에서의 억제, Knock-Out 쥐에서 발생되는 암 등의 다양한 연구를 통해 증명되었다 (1-4). 대부분의 암 억제 단백질과 같이 PTEN의 단백질 수준 억제는 Human Cancer에서 빈번하게 관찰되지만 이 중 25% 정도만 유전적인 PTEN의 Mutation으로 확인되면서, PTEN의 단백질 수준에서의 조절(Posttranslational Modifications, PTMs)이 활발하게 연구되고 있다 (4-6). 특히, PTEN의 PTMs 중 단백질 안정도(Stability)를 조절할 수 있는 유비퀴틴화에 관한 연구가 암에서 빈번하게 관찰되는 PTEN의 단백질 수준 억제를 설명해 줄 수 있을 것으로 생각되고 있다.

유비퀴틴화(Ubiquitination)는 유비퀴틴 결합효소(E3-Liagse)와 유비퀴틴 탈착효소(deubiquitinase)에 의해 조절되며 유비퀴틴화 된 단백질은 프로테아좀(Proteasome)에 인식되어 분해되고, 이러한 과정을 통해 유비퀴틴화를 통한 단백질 수준 조절이 이루어 진다. PTEN 역시 유비퀴틴화를 통한 조절이 이루어지는 것이 연구되어 있고, 몇 가지 유비퀴틴 결합효소 및 유비퀴틴 탈착효소(NEDD4-1, WWP2, XIAP, CHIP, SPOP, USP7 (HAUSP), USP13)가 PTEN의 단백질 수준을 조절하는 것으로 보고되었다 (6-10).

  PTEN의 유비퀴틴화를 통한 단백질 수준 조절이 몇 가지 암에서 관찰되고 있지만, ‘PTEN의 유비퀴틴화를 조절하는 유비퀴틴 결합효소 및 유비퀴틴 탈착효소가 조절되는 기전’과 ‘암이 발생하는데 유비퀴틴화를 통한 PTEN 단백질 수준의 조절이 어떻게 이루어지고 있는지’에 관한 연구가 필요한 상황이다. 이에 본 연구진은 PTEN을 조절하는 새로운 유비퀴틴 결합효소 MKRN1을 찾고 발암신호전달에 따른 MKRN1 및 PTEN 단백질이 조절기전에 대해서 연구하게 되었다.

연구결과

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​1.   MKRN1에 의한 PI3K/AKT 신호 조절

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​암유전자(Oncogene)로 연구되고 있는 MKRN1이 암세포의 다양한 신호전달 중 어떤 신호전달에 관여하는지 Human Phospho-Kinase Array를 통해 확인한 결과 MKRN1이 억제된 암세포 주에서 발암신호전달 중 AKT 신호가 강하게 저해됨을 관찰하였다 (그림 1A). 이러한 결과는 MKRN1이 Knockout된 Mouse Embryonic Fibroblasts(MEFs)에서도 동일하게 관찰되었으며, 이때 PI3K/AKT 신호의 억제 단백질인 PTEN이 증가하는 것을 관찰하였다 (그림1 B, C). 이를 통해 MKRN1의 억제 시 활성화된 PTEN을 통하여 PI3K/AKT 신호 억제를 유도할 수 있다는 가설을 세울 수 있었고, 암세포 주에서 PTEN이 억제된 환경에선 MKRN1이 PI3K/AKT 신호를 더 이상 조절할 수 없음을 확인함으로써 이를 증명하였다 (그림 1D).

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그림 1. MKRN1의 억제는 PTEN을 통해 PI3K/AKT 신호를 저해함

암세포 주에 siRNA의해 MKRN1이 억제(Knockdown) 되거나 Knockout 되면, 다양한 신호 전달 중 PI3K/AKT 발암신호기작(pAKT, pS6K, pGSK3β)이 특이적으로 저해됨을 관찰하였다 (A-C). ​또한 MKRN1의 억제가 PTEN의 단백질을 증가시키고 이를 통해 PI3K/AKT 신호를 저해하는 것으로 관찰하였다 (D).

앞선 AKT/MKRN1/PTEN의 분자적 조절 확인을 기반으로 pAKT와 MKRN1, PTEN의 발현양상이 자궁경부암에서 유의성을 보이는지 확인하였다. 조직면역법을 사용하여 각 병기(Stage)별 자궁경부암 환자 조직에서 pAKT와 MKRN1, PTEN의 단백질 수준을 정량한 결과, 병기(Stage)가 올라갈수록 pAKT와 MKRN1이 유의성 있게 증가하고 PTEN의 경우 유의성 있게 감소하는 것을 확인하였다 (그림 2A). 이러한 pAKT와 MKRN1의 양의 관계와 MKRN1과 PTEN의 음의 관계는 자궁경부암 환자의 5년간 생존률에도 크게 유의성이 있는 것으로 관찰되었다 (그림 2B). 즉, pAKT와 MKRN1이 높게 발현되고 PTEN의 발현이 낮게 유지되는 자궁경부암 환자일수록 5년 생존률이 현저히 낮은 것이다. 이러한 결과를 기반으로 하여, PI3K/AKT가 MKRN1을 활성화시켜 PTEN의 단백질 수준을 저해함으로써 암 발생을 유도하고 암에서 PI3K/AKT 신호가 강력하게 유지될 수 있도록 하는 새로운 발암기전의 가능성을 확인하였고 이를 순차적으로 확인하였다.  

​그림 2. Human Cervical Neoplasia에서 pAKT와 MKRN1, PTEN의 발현 및 분석

The Tissue Microarray(TMA)를 통해 190 Case의 자궁경부암 환자를 관찰하였다. Normal, Low-Grade CIN, High-Grade CIN and Invasive Cervical Cancer Tissues에서 Stage에 따라 pAKT, MKRN1을 증가하는 양의 관계를 PTEN의 경우 저해되는 음의 관계를 보였다 (A). 또한 pAKT, MKRN1이 높을수록, PTEN은 낮을수록 자궁경부암 환자의 Overall Survival이 좋지 못하였다 (B).

​MKRN1 단백질에 종간 잘 보존된 AKT의 인산화 표적 단백질 서열이 존재함을 확인하고, MKRN1의 Serine 109에 AKT에 의한 인산화가 일어날 수 있음을 증명하였다 (그림 3A, B). 이러한 PI3K/AKT에 의한 MKRN1의 인산화가 MKRN1의 단백질 안정화 및 활성화를 유도할 수 있는지 확인하였다. 활성화된 AKT의 형태인 myr-AKT에 의해 MKRN1의 단백질 수준이 증가하고, MKRN1의 단백질 안정도(Stability)가 크게 증가함을 확인하였다 (그림3 C, D). 또한, AKT에 의한 인산화가 MKRN1의 유비퀴틴화를 억제시켜 MKRN1의 단백질 수준을 증가시키는 것임을 다양한 분자적 실험을 통하여 증명하였다 (그림 3E). 결과적으로, PI3K/AKT신호의 새로운 신호단백질로 MKRN1이 인산화 되고 활성화 되는 것을 관찰하였고, 이는 환자 및 암세포 주의 pAKT와 MKRN1의 양의 관계를 설명하고 있다.

그림 3. AKT에 의해 유도되는 MKRN1의 인산화 및 안정화

MKRN1의 AKT 인산화 표적 단백질 서열 (A). in vitro에서 AKT에 의해 MKRN1의 109번째 Serine이 인산화됨을 확인하였다 (B). myr-AKT에 의해 MKRN1의 단백질 수준이 증가하고, 단백질 안정도가 증가함을 확인하였다 (C, D). 표피생장인자 EGF(Epidermal Growth Factor)에 의해 활성화된 AKT가 MKRN1의 유비퀴틴화를 억제함을 확인하였다 (E).