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크리스퍼 유전체 교정기법의 최신 응용 연구 동향

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  • 작성일자

    2017-08-01
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크리스퍼 유전체 교정기법의 최신 응용 연구 동향

김은하

아주대학교 분자과학기술학과

ehkim01@ajou.ac.kr

1. 서론

  

 최근 유전성 신경 대사 장애인리증후군(Leigh Syndrome)’ 치료를 위해 세 사람의 DNA를 물려받은 아이의 탄생은 유전자 교정 기술의 가능성을 보여주며 세간의 주목을 집중시켰다. 마흐무드 하산 부부의 경우 미토콘드리아 DNA변이에 의해 두 명의 자녀를 잃자 연구진을 통해 아이 엄마의 난자에서 핵만 빼내 정상 미토콘드리아를 보유하고 있는 정상 난자 제공자의 핵을 제거한 난자에 주입한 후 아이 아버지의 정자와 수정시켜 자궁 착상 후 건강한 아이를 얻게 된 것이다. 비록 이러한 유전자 조작 기술을 활용한 기술이 여러 가지 윤리적인 문제를 수반하고 있는 것이 사실이지만 관련 기술을 기반으로 한 여러 회사들의 출현과 최신 연구 결과들을 놓고 볼 때 머지않은 미래에 이러한 유전자 치료가 보편화될 가능성이 높을 것으로 판단된다.

 

 이러한 유전자 교정 기술이 세간의 주목을 받게 되었던 계기는 티모시 브라운의 백혈병 치료에서 시작되었다. 의료진은 백혈병 치료를 위해 조혈모세포 이식수술을 시행하였는데, 그 결과 에이즈 환자이기도 했던 티모시 브라운의 에이즈 바이러스가 사라진 사실을 발견하게 된 것이었다. 연구 결과 조혈모세포 기증자의 CCR5 바이러스 수용체 유전자에 돌연변이가 있었다는 사실을 알게 되었고 이를 기증받은 티모시 브라운은 관련 유전자를 조혈모세포 이식수술을 통해 자연스럽게 받게 됨으로써 에이즈 바이러스가 사라지게 된 것이다. 이러한 결과를 바탕으로 Sangamo Biosciences, Inc.는 현재 Zinc Finger Nuclease(ZFN)을 이용한 CCR5 Knockout 시키는 기술에 대해 미국 식품의약청(FDA) 승인 하에 임상실험을 진행 중에 있다. 인간 유전체 프로젝트 이후 차세대 염기 서열 분석 방법 등의 도래로 인해 많은 수의 유전 정보의 기능과 역할이 알려지게 되면서 이제 DNA 배열에 원하는 변이를 도입하는 기술들에 대한 요구가 증대되었고 이는 유전체 자체의 연구뿐만 아니라 사람들의 질병 치료에 혁명적인 기술로 자리매김하고 있는 것이다.

 

 이러한 유전체 편집(Genome Editing) 기술 중 유전자 가위 기술이 최근 화제다. 그 중심에 서있는 기술은 바로 크리스퍼(CRISPR; Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 유전체 교정 기술이 되겠다. 특히 크리스퍼 기술은 미국 사이언스지 선정 2015년 최고 혁신 기술로 선정되었고, 한국생명공학연구원에서 발표한 2017년 바이오 미래 유망기술 중의 하나로 꼽히기도 하였다. 이러한 유전자 가위의 시작은 잘 알고 있는 것처럼 1970년대 제한 효소로부터 시작한다. 사람들은 자연계에 존재하던 제한 효소(Engineered Nuclease)라 불리는 유전자 가위를 이용하여 유전체에 이중 가닥 깨짐(Double-Strand Break; DSBs)을 유도하고 이후 세포 내에 존재하는 두 가지 서로 다른 수선 체계인 비상동재접합(Non-Homologous End Joining; NHEJ)과 상동 재조합(Homologous Recombination; HR) 방법을 이용하여 유전자 교정이 가능하다는 사실을 알게 되었다. 하지만 기존에 사용되던 제한 효소의 경우 인식할 수 있는 서열의 길이가 너무 짧아 그 제한 점이 많이 존재하였다. 따라서 이러한 유전자 가위들을 개량하고자 하였고 그 결과 ZFN, TALEN을 거쳐 현재의 크리스퍼 기술에 이르는 유전자 가위들을 개발해오게 되었다. 유전체 교정기술들의 장단점으로 인해 자신이 원하는 실험 종류에 따라 사람들이 서로 다른 기술들을 활용하고 있으나 (1), 이번 총설에서는 현재 유전체 교정의 가장 중요한 화두인 CRISPR 기술에 대해 알아보고자 한다. 크리스퍼 기술의 역사와 원리에 대해서는 유전체 교정 기법의 민주화라는 제목으로 이전에 잘 소개된 바 있어 이번엔 최근 크리스퍼 유전체 교정 기법을 활용한 응용 연구들의 동향과 접근법에 대해 몇 가지 연구 결과들을 중심으로 간단히 살펴보고자 한다.


2. 본론 

 

2-1. 기능유전체학을 위한 CRISPR 기술 

 

 

 이러한 크리스퍼 기술은 누구나 편하고 쉽게 유전체 교정을 가능하게 해주었고 이러한 영향으로 인하여 수많은 응용 연구들이 진행되고 있다. 그중 하나 눈 여겨 볼 점은 크리스퍼 기술을 활용한 기능유전체학 연구이다. 크리스퍼 기술을 활용하여 수 많은 유전자들을 매우 정교하게 그리고 손쉽게 교정할 수 있게 됨으로써 사람들은 이제 기능 소실/획득 돌연변이(Loss/Gain of Function Mutation)를 지니는 세포 풀을 손쉽게 만들 수 있게 되었고 이를 활용한 기능 유전체학 연구를 매우 효율적으로 진행할 수 있게 되었다. 크리스퍼 기술의 이러한 초기 응용 연구는 2014년 두 연구 그룹에 의해 발표되었다. 예를 들어 영국 웰컴 트러스트 생어 연구소 Kosuke Yusa 연구팀은 크리스퍼 시스템을 이용하여 Cas9를 발현하는 생쥐 배아 줄기세포에 렌티바이러스 gRNA Library를 이용하여 돌연변이 생쥐 배우줄기세포 라이브러리를 구축하였다 (2). 그 뒤 연구팀에서는 Alpha-Toxin 과 6-Thioguianine(6-TG)에 대해 저항성을 지니는 세포를 찾아내어 저항성 관련 유전자를 찾아내는데 성공하였다. 한편 비슷한 시기에 MIT의 Eric S. Lander 연구팀에서는 CRISPR-Cas9 System과 Single-Guide RNA(sgRNA) Library를 이용하여 DNA Mis-Match Repair(MMR)에 관련된 Gene들을 스크리닝하는데 성공하였다 (3). 연구팀에서는 73,000개의 sgRNA를 지니는 렌티바이러스 풀을 이용하여 관련 Gene들이 Knockout된 세포 라이브러리를 얻어내는데 성공하였고 이러한 세포 라이브러리에 6-Thioguanine(6-TG)를 처리하여 MMR에 연관이 있는 MSH2, MSH6, MLH1 그리고 PMS2 와 같은 유전자들을 타겟하는 sgRNA들이 살아남은 세포에서 많이 남아 있음을 확인할 수 있었다. 이후 연구팀에서는 같은 접근법을 통해 세포 증식 관련 표현형 변화에 영향을 주는 유전자들에 대한 연구를 진행할 수 있었다.

이러한 초기 연구를 바탕으로 최근 몇 년 동안 관련 응용 연구들이 증가하고 있다. 특히 크리스퍼 기술을 이용한 형질전환 동물 모델 구축의 용이성으로 인해, Primary 세포에서의 기능 유전체학 연구가 활발히 행해지고 있는 것을 알 수 있다. 일 예로 미국 브로드 연구소의 Aviv Regev 연구팀에서는 Cas9 발현 형질전환 생쥐의 Bone-Marrow-Derived Dendritic Cells(BMDCs, or DCs)에 sgRNA들을 지니는 렌티바이러스 라이브러리를 처리한 후 Lipopolysaccharide(LPS)를 처리하여 Tumor Necrosis Factor(TNF) 분비에 영향을 주는 유전자에 대해 살펴보고자 하였다 (4). 연구팀에서는 먼저 LPS의 인지와 TNF 유도 그리고 TNF mRNA를 불안정화 시키는 유전자인 Tlr4, Myd88, Zfp36 Gene을 타겟으로하는 sgRNA를 이용하여 BMDCs를  변형시켰다. 이후 LPS와 Brefeldin A 처리하여 TNF의 발현 양을 FACS를 이용하여 관찰하였다. Tlr4, Myd88를 타겟하는 sgRNA는 TNF를 증가시키고 Zfp36의 경우에는 감소시킴을 확인하여 Cas9 발현 형질 전환 생쥐에서 유래한 Primary Cell에 크리스퍼 기술을 이용한 전장 유전체적(Genome Wide) 스크리닝이 가능함을 검증하였다. 그 뒤 연구팀에서는 125,793개의 sgRNA를 이용하여 21,786개의 단백질 코딩 유전자와 miRNA 을 Target하는 sgRNA 렌티바이러스 라이브러리를 구축하고 BMDCs에 처리하였다. 이러한 과정을 통해 연구팀에서는 기존에 알려지지 않았던 LPS에 반응하여 TNF 발현을 조절하는 유전자들(Tti2, Ruvbl2, Tmem258, Midn, Ddx39b, Stat5b and Pdcd10)을 확인할 수 있었다.

 

이러한 기능 유전체학적 접근은 저분자 약리 활성 물질에 대한 타겟 동정에도 계속 활용되어져 왔다 (5). 따라서 크리스퍼 기술을 활용한 기능 유전체학의 발전은 저분자 약리 활성 물질에 대한 연구에도 획기적인 변화를 주고 있다. 노바티스 생명의학연구소(Novartis Institutes for Biomedical Research; NIBR)의 Yan Feng 연구팀에서는 CRISPR-Cas9기술과 KBM7 세포의 특징을 활용하여 6-TG 저항성을 지니는 세포가 HPBRT1 유전자에 대해 기능 소실 돌연변이가 생겼음을 확인하고 HCT116세포주에 대해 크리스퍼 기술을 활용한 HPRT1 Knockout 세포가 6-TG에 대한 내성이 생김을 확인하였다. 그 뒤 동일 연구팀에서는 항암제의 일종인 Triptolide에 대해 같은 접근법을 통해 내성을 지니는 세포를 찾아내고 Amplicon Sequencing 기술을 활용하여 기존에는 표적으로 알려져 있지 않던 ERCC3 유전자에 기능변화 돌연변이가 있음을 확인할 수 있었다.

 

크리스퍼 기술을 활용한 기능 유전체학적 접근은 세포 수준뿐만 아니라 동물모델에서의 연구에도 활용되고 있다. MIT 코흐 연구소 Philip Sharp 교수와 MIT의 Feng Zhang 교수팀은 크리스퍼 기술을 활용한 전장 유전체적 스크리닝 방법을 통해 생쥐모델에서의 암전이 관련 기능 유전체학 연구를 수행할 수 있었다 (6). 이 연구에서 연구자들은 먼저 Kras, p53, Dicer에 각각 돌연변이가 있는 Mouse NSCLC 세포(KrasG12D/+;p53 / ;Dicer1+/ , 이하 KPD)에 GFP가 결합된 Cas9을 발현하는 Cell Line(이하 GFP-KPD)을 만든 후 여기에 20,611개의 유전자를 타겟으로 하는 67,405개의 sgRNA(이하 mGeCKOa; Mouse Genome-Scale CRISPR Knockout Library A)를 이용하여 Mutant Cell Pool을 만든 후 이를 Nu/Nu 생쥐에 이식하였다. 6주 뒤 연구팀에서는 mGeCKOa에 의해 Mutation된 GFP-KPD세포를 이식한 쥐에서 폐로 암 전이가 일어난 것을 확인할 수 있었고 GFP-KPD 세포를 이식한 쥐에서는 폐로의 암 전이가 일어나지 않았다는 것을 형광 현미경을 통해 확인하였다. 그 결과 처음에 생기는 Primary Tumour에서는 전체 sgRNA의 반 정도가 남아있는 것을 확인할 수 있었고 이후 후기 단계로 넘어 가게 되는 경우 Anti-Apoptotic 유전자 혹은 Tumor Suppressor 유전자들을 타겟하는 sgRNA들을 지니는 세포가 대다수 남게 되는 것을 확인하였다. 흥미로운 점은 이렇게 후기단계 종양에서 발견되는 sgRNA들이 전이된 곳의 암에서 많이 발견되는 sgRNA들과 상당히 겹친다는 점이다. 이러한 연구를 통해 연구자들은 Nf2, Pten, Cdkn2a, Trim72, Fga, miR-152, miR-345와 같은 Tumor Suppressor Gene들을 타겟하는 sgRNA가 전이암 세포들에서 많이 남아 있다는 것을 확인하였다.



 

 

 

2-2. 크리스퍼 기술을 활용한 in vivo 유전체 편집

 

 

 이러한 크리스퍼 기술은 기존에 많은 제한점이 있었던 in vivo​ 상에서의 유전체 편집과 형질 전환된 실험동물들의 손쉬운 개발을 가능하게 하여 in vivo 상에서의 질병 연구에 큰 도움을 줄 수 있는 새로운 돌파구를 제시해주고 있다 (7). 2014년 미국 메모리얼 슬론 케터링 암센터의 Andrea Ventura 연구팀에서는 Chromosomal Rearrangement 관련 질환 연구를 위한 in vivo​ 상에서의 유전체 편집을 시도하였다 (8). 이 연구팀에서는 비소세포 폐암(Non-Small Cell Lung Cancer; NSCLC) 유발 인자로 잘 알려져 있는 Chromosome Rearrangement에 의한 EML4-ALK Oncogene 발현을 크리스퍼 기술을 이용하여 in vivo​ 상에서 일어나도록 유도하였다. 연구진에서는 크리스퍼 기술을 활용하여 Eml4의 인트론 14 위치와 Alk의 인트론 19 위치에 DSB를 유도하기 위해 각각을 표적으로 하는 sgRNA와 Cas9 Cassette를 Adenoviral Shuttle Vector에 삽입하고 이를 Adenovirus(이하 Ad-EA)를 활용하여 MEF에 주입시켰다. 이를 통해 연구진에서는 Ad-EA에 감염된 쥐가 사람의 ALK+ NSCLC와 유사한 성질을 지닌다는 것을 확인할 수 있었고 Crizotinib에 민감하게 반응한다는 것을 확인하여 크리스퍼 기술을 활용하여 사람의 ALK+ NSCLC유도과정과 동일한 과정을 거쳐 암세포 발생을 in vivo​ 모델에서 재현할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

크리스퍼 기술은 in vivo 상에서의 유전체 편집을 벗어나 포유류 배아의 유전체 교정을 통해 개체 자체의 유전체 교정을 매우 손쉽게 일어나도록 하는데도 활용되기 시작했다. 2015년 난징대학교의 State Key 재생의학 연구소 Jiahao Sha 연구팀에서는 원숭이 배아의 유전체를 Cas9과 sgRNA를 통해 편집함으로써 유전체가 교정된 원숭이를 태어나게 하는데 성공했다 (9). 연구팀에서는 Nr0b1(Nuclear Receptor Subfamily 0 Group B Member 1), Ppar-γ(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma), Rag1(Recombination Activating Gene1)을 타겟하는 sgRNA와 Cas9 mRNA를 마이크로인젝션을 통해 단일 세포 상태의 쥐의 배아에 동시에 주입하였다. 그 뒤 PCR과 T7EN1 Assay를 통해 살펴본 결과 높은 효율로 타겟 유전자들이 Mutation되어 있음을 확인하였다. 크리스퍼 기술이 생쥐배아에서 적용됨을 확인한 후 연구팀에서는 인공 수정 시킨 수정란에 Cas9과 sgRNA를 Coinjection하고 이후 이중 일부를 대리모 원숭이에 이식하였다. 이후 탯줄이나 태반 등에 있는 세포를 통해 PCR과 T7EN1 에세이를 진행해본 결과 타겟 Rag1, Ppar-γ 유전자에 변형이 일어났음을 확인함으로써 연구진에서는 크리스퍼 기술이 원숭이 배아에 적용 가능함을 확인하였다.

 

 

 

2-3. 크리스퍼 기술을 활용한 질병치료

 

 

 최근 IBS 김진수 단장 연구팀에서는 노인 황반 변성(Age-Related Macular Degeneration; AMD)의 치료가 유전자 교정에 의해 가능하다는 사실을 보고하였다. AMD가 발생하는 이유 중 하나는 VEGFA의 과발현에 의한 맥락막혈관신생(CNV)과 이로 인한 시력상실이다. 따라서 이를 치료하기 위해 VEGFA 항체를 계속 투여하는 방법이 사용되고 있지만, 그 한계가 존재한다. 이에 연구팀에서는 VEGFA를 표적으로 하는 Cas9 Ribonucleoprotein을 만들고 이를 AMD 쥐 모델에 처리하여 망막색소상피(Retinal Pigments Epithelium)에 국부적으로 유전체 교정을 일으킬 수 있었다. 이러한 접근 방법을 통하여 연구팀에서는 망막색소상피세포에서 VEGFA의 발현이 사라지고 넣어 주었던 Cas9 RNP는 3일 이내에 사라진다는 것을 확인하였다 (10).

크리스퍼 기술을 활용한 유전자 드라이브는 유전체 교정 기술을 활용한 전염병 치료 응용에 대한 대표적인 예라고 할 수 있겠다. 2015년 UC 어바인의 Anthony A. James 연구팀에서는 말라리아 박멸을 위한 크리스퍼 기술 기반 유전자 드라이브 시스템을 고안하였다 (11). 2015년 미 국립과학원회보(PNAS)에 보고된 이 내용은 기존에 동일 연구팀에서 개발한 말라리아 저항성 유전자를 (12) 많은 수의 모기에게 전파하는 방법을 크리스퍼 기술을 이용하여 개발하였다. 그 결과 유전체가 교정된 모기의 후손의 99%가 말라리아에 대해 정상적으로 작동하는 항체를 발현하는 것을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라, 이러한 크리스퍼 기술을 이용한 유전자 드라이브 시스템을 통해 말라리아를 옮길 수 있는 암컷 모기들이 불임 유전자를 갖도록 유도하였으며 그 결과 4세대가 지난 이후 이 불임 유전자를 갖는 암컷 모기들의 수가 75%에 이른다는 것이 최근 보고되었다 (13).

 

2-4. CRISPR Cas9의 대체 기술의 개발 CRISPR-Cpf1.

 

 

 이러한 크리스퍼 기술도 한계점들이 보고되고 있다. 예를 들어 기존 크리스퍼 시스템의 경우 Blunt End Type으로 DSB가 만들어지고 난 후 대다수가 NHEJ 방식에 의해 복구되기 때문에 원하는 기존 Knockout에 있어서는 그 이전 유전체 교정 방법보다 매우 뛰어난 능력을 보여주나, Knockin에 있어서는 드물게 일어나는 HDR 방식에 의존할 수밖에 없었고 이러한 이유로 HDR 방식의 복구 과정을 증가시키는 노력을 통해 Knockin 효율을 증가시키려는 시도가 보고되었다 (14). 또한 크리스퍼 기술의 정확성도 기존 방식보다 훌륭하긴 하나 완벽하지 않다는 보고가 계속되고 있어 이를 대체할 수 있는 시스템을 찾고자 하는 노력들이 계속되고 있다 (15,16). 이러한 노력의 일환으로 브로드 연구소 Feng Zhang 연구팀에서는 크리스퍼 시스템을 위한 새로운 단백질인 Cpf1을 찾았다고 2015년 보고하였다 (17). 연구팀에서는 Trans-Activating crRNA(tracrRNA)가 필요 없는 single RNA-Guided Endonuclease인 Cpf1가 5’-NGG-3’를 PAM Sequence로 인지하는 기존에 Cas9 과 달리 5’-TTTN-3’ 혹은 5’-YAN-3’ 을 PAM으로 인지하여 DNA를 인지하고 특히 Sticky End를 만들며 DNA를 자른다는 것을 확인하였다. 이는 다시 말하면 교정하고자 하는 DNA의 선택폭을 넓혀 줄 수 있고 크리스퍼 시스템을 이용한 Knockin 가능성을 높여준다고 볼 수 있겠다.

뿐만 아니라 이러한 Cpf1이 정확성이 기존 시스템보다 더 정확하다는 것이 최근 보고되었다. 서울대 IBS 김진수 단장 연구팀에서는 기존에 동일 연구팀에서 개발한 Digenome-Seq 방법을 사용하여 (18) Cas9 과 Cpf1을 활용한 크리스퍼 시스템이 어떠한 선택성 차이를 보이는지를 전장 유전체적 스크리닝을 통해 살펴보았다. 그 결과, Cpf1을 사용하였을 때 Cas9을 사용했을 때 보다 비표적 위치를 절단한 경우가 현저히 적음을 관찰하였다. 특히 Cpf1 단백질과 크리스퍼 RNA를 혼합하여 동시에 세포에 전달하게 되면 매우 높은 선택성으로 원하는 표적 위치만을 절단시킬 수 있다는 것을 보고하였다 (19). 이러한 Cpf1은 기존 Cas9에 비해 가격적으로 저렴하고, 100nt를 인지하던 Cas9에 비해 비교적 짧은 42nt 정도를 인지하는 특징이 있다. 또한 Cpf1은 Cas9에 비해 크기가 작아 세포에 전달하기가 용이하고, PAM으로부터 18~23bp 정도 아래의 위치를 자르기 때문에 PAM Site를 건드리지 않는 특징이 있다. 따라서 여러 번 같은 곳을 자를 수 있어 원하는 유전체 교정이 일어날 확률이 높아지게 된다. 현재는 Acidaminococcus sp. Cpf1(AsCpf1)과 Lachnospiraceae Bacterium Cpf1(LbCpf1) 효소가 포유류 유전자 교정 기술에 활용되고 있으며 최근 이렇게 개량된 크리스퍼 시스템을 이용하여 하나 이상의 유전자를 동시에 교정할 수 있다는 사실이 Feng Zhang 연구팀에 의해 보고되었다 (20).

3. 결론

크리스퍼 기술을 이용한 유전체 교정 기술의 발달로 인해10년도 되지 않는 짧은 기간 동안 수많은 연구 분야에 획기적인 변화가 일어나고 있다. 이제 크리스퍼 기술을 이용하여 누구나 손쉽게 사람을 포함하여 지구상에 존재하는 거의 모든 생물의 유전체 정보를 마음먹은 대로 수정할 수 있게 되었다 해도 과언이 아니다. 따라서 이는 기존에 접근하기 어려웠던 여러 가지 질병 문제의 해결과 동물과 식물의 개량을 통한 식량난의 해결, 약물의 타겟 동정 등 인류에게 수많은 선물을 가져다 줄 것이라 예견되고 있다. 하지만 손쉬운 유전체 교정으로 인해 매우 빠른 속도로 생태계의 교란을 야기시킬 수도 있고, 사람의 유전자를 조작할 수 있는 윤리적인 문제도 존재하고 있다. 여러 가지 논란에도 불구하고 크리스퍼 기술 사용의 확산은 불가피해 보이며 이에 따른 일상생활에 미치는 영향은 매우 가까운 미래에 현실화되리라 판단된다. 다우드나 박사와 유수의 외국 연구자들의 노력에서 보듯 우리도 이러한 막강한 기술인 크리스퍼 사용에 대한 논의가 필요한 시점이라고 생각된다.  

 

 

 

 

참고문헌

 

 

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