생화학분자생물학회

 단분자 면역침강을 이용한 단백질 복합체에 대한 생화학적 연구

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1.      서론

생체 내에서 이루어지는 수많은 반응들의 대부분은 단백질들 간의 상호작용(Protein-Protein Interaction, 이하 PPI)이 동반되게 된다. 예를 들어, EGFR 신호전달 경로에서는 수용체가 리간드에 결합하여 EGFR가 인산화되면 Grb2, PI3K 등의 단백질들이 결합하게 되고, 이들 단백질들에 다른 단백질들이 차례로 결합하여, 최종적으로는 관련된 유전자들이 전사되는 과정이 일어나 세포분열이 촉진되는 등의 현상으로 이루어지게 된다. 이때 단백질들 간의 PPI를 분석함으로써 이러한 과정에 관여하는 인자들에 대해 알 수 있다. 또한 PPI를 정량적으로 분석하여, 단백질 복합체 내에 특정 단백질이 몇 개가 존재하는지, 그리고 단백질 복합체가 형성되는 동역학에 대하여 알 수 있다.

PPI를 분석하기 위해 사용되는 대표적인 방법은 공-면역침강법(co-Immunoprecipitation, 이하 co-IP)이며, 이 방법을 통하여 많은 PPI들을 분석할 수 있었다. 하지만 기존 co-IP 실험에서는 다음과 같은 한계들이 존재한다. 먼저 co-IP의 특성상 이미 형성된 단백질 복합체를 관찰하기 때문에, 이 복합체를 이루고 있는 단백질들이 결합하는 과정에서의 반응속도 등을 알 수 없으며, 단백질들이 복합체에 어떤 형태로 결합하는지, 그리고 특정 단백질들이 어떠한 비율로 결합하는지를 알 수 없다. 두 번째로, co-IP에서는 비특이적으로 결합한 단백질들을 제거하기 위하여 완충용액 등으로 씻어내는 단계가 있는데, 이 단계에서 단백질 복합체에 상대적으로 약한 상호작용을 하는 단백질들 또한 떨어져 나가기 때문에, 강한 PPI만을 관찰할 수 있다. 세 번째로, 분석을 위해서 전기영동을 하고 웨스턴 블롯을 하는 과정에서 하루나 이틀 정도의 긴 시간이 소요된다 (1).

단분자 면역침강 기법은 기존 co-IP 실험에 비해서 짧은 시간 안에 적은 시료를 사용하여 상대적으로 약한 PPI를 분석할 수 있다. 특히, 복합체에서 특정 단백질이 몇 개 붙어 있는지, 그리고 단백질 복합체를 형성하는 과정에서 PPI의 동역학적 속도를 실시간으로 분석할 수 있다. 이 글에서는 단분자 면역침강 기법과 이 기법이 응용된 사례들을 소개하려 한다.

2.      본론

2-1. 단분자 면역침강 기법의 개요

기존 co-IP 분석에서는 입자 표면에 항체를 붙인 뒤 목적 단백질을 입자 표면에 결합시키는데, 단분자 면역침강 기법에서는 유리 기판을 화학 처리하여 Poly-Ethylene Glycol(PEG) 고분자로 표면을 코팅한다. 이러한 고분자 코팅의 결과로 비특이적인 단백질들이 표면에 결합하는 것을 막으며, 후에 Biotin과 Avidin 간의 강한 결합을 통하여 표면에 항체를 결합시킬 수 있다.

PEG으로 코팅된 유리 기판을 이용하여 유동 채널(Flow Channel)을 만든 뒤, 유동 채널 내부에 용액을 흘려보내어 슬라이드 표면에 항체를 고정시키고, 목적 단백질(또는 목적 단백질을 포함하는 단백질 복합체)을 항체를 이용하여 표면에 면역침강시킨다. 그 뒤, 표면에서 나타나는 형광 신호를 전반사 형광 현미경으로 볼 수 있는데, 이때 1) 목적 단백질 자체를 형광을 내는 분자로 표지하거나, 2) 형광 분자로 표지된 항체를 결합시켜 표지된 항체의 신호를 보거나, 3) 또는 목적 단백질과 상호작용하는 것으로 예상되는 다른 단백질을 형광 분자로 표지하여 이들 단백질들이 목적 단백질과 상호작용할 때 나타나는 형광 신호를 관찰할 수 있다 (2,3).

그림 1. 단분자 면역침강 기법 개요

따라서 이 기술을 이용하여 단분자 수준에서 원하는 단백질들을 선택적으로 표면에 고정시켜 그 특성을 관찰할 수 있으며, 단백질 간의 상호작용을 실시간으로 확인할 수 있다. 이 기술은 기존에 널리 사용되고 있는 co-IP가 갖고 있는 한계점들을 다음과 같이 극복할 수 있다. 먼저 단백질들 간의 상호작용을 co-IP와 같이 이미 형성된 복합체를 보는 것이 아니라, 실시간으로 복합체가 형성되는 과정을 관찰할 수 있기 때문에 상대적으로 약한 PPI 또한 볼 수 있으며 PPI의 동역학 정보를 정량적으로 분석할 수 있다. 또한 단백질들을 여러 가지 색의 형광을 내는 염료나 단백질로 표지하여 복합체가 어떠한 형태로 만들어지는지 알 수 있으며, 광퇴색(Photobleaching)이 일어나는 과정을 관찰하여 단백질 복합체 안에 어떠한 단백질이 몇 개나 있는지 또한 알 수 있다. 마지막으로 단분자 면역침강 실험의 소요시간은 약 4시간으로, 약 1-2일이 걸리는 co-IP에 비해 빠르게 결과를 확인할 수 있다 (3).

2-2. 작용 사례 1: 단분자 면역침강을 응용한 단백질 복합체의 구조, 기능 규명

이러한 단분자 면역침강 기술을 이용하여 생체 내에서 기능하고 있는 여러 가지 단백질 복합체의 기능들을 규명할 수 있었다. 그 예로, 단분자침강 기법을 이용하여 miRNA의 전구체인 pre-miRNA를 유리딘화시켜 miRNA가 형성되는 과정을 조절하는 단백질인 TUT4의 작동 메커니즘을 규명할 수 있음이 보고되었다 (4). 슬라이드 표면에 형광 단백질인 mCherry로 표지된 TUT4 단백질 복합체를 고정시킨 뒤, 형광 염료인 Cy3로 표지된 let-7 pre-miRNA와 Lin28 단백질을 넣은 뒤 이들 분자들이 표면에 고정되는 것을 확인하였다. 그다음, 유동채널에 UTP를 넣어 이들 복합체가 pre-miRNA를 유리딘화시키게 하면서, Cy3으로 표지된 폴리아데닌을 넣은 뒤 Cy3 형광 신호의 세기가 시간에 따라 증가하는 것을 통해 pre-miRNA가 유리딘화되는 것을 실시간으로 관찰할 수 있었다. 또한, TUT4는 pre-let-7 miRNA와 결합할 수 있지만 이 상호작용은 매우 약하고 일시적인데, Lin28 단백질이 pre-let-7 miRNA와 결합하여 TUT4와 pre-let-7 miRNA가 안정적으로 결합할 수 있게 한다는 것도 확인하였다.

또한 단분자 침강기법을 이용하여 생물학적 환경에서 단백질 복합체의 구성을 볼 수 있고, 조건에 따라 이러한 구성이 어떻게 동적으로 변하는지 확인할 수 있다. 만약 여러 개의 같은 목적 단백질들이 같은 복합체 내에 포함되어 있다면, 표면에 이 복합체가 동시에 침강될 것이다. 침강된 복합체 안의 목적 단백질들이 형광 단백질이나 형광 염료를 통하여 표지되어 있는 상태에서 지속적으로 빛을 받을 경우 광퇴색이 일어나 복합체에 해당하는 형광 신호의 세기는 시간에 따라 감소하면서 계단 형태의 궤적을 그리게 된다. 이때 이 궤적에서 나타나는 계단 턱의 개수를 분석하여 복합체 내의 단백질의 개수를 알 수 있다. 이러한 방법을 mTOR 복합체나 전압 의존성 소듐 채널 등의 단백질 복합체에 적용할 수 있었다 (5,6).

그림 2. (ㄱ) 광퇴색에 따른 신호 세기 변화의 예시, (ㄴ) 단백질 핑거프린팅의 모식도

이러한 단분자 면역침강법은 단순히 단백질의 기능을 보는 것 이상으로 확장할 수 있다. 단백질 복합체를 표면에 고정하여 복합체의 구동을 실시간으로 관찰할 수 있기 때문에, 이를 응용하여 대장균에서 접혀 있는 단백질을 풀은 뒤, 이를 분해하는 ClpXP 단백질을 통하여 단분자 수준에서 단백질을 핑거프린팅 할 수 있었다 (7). 형광 염료로 표지된 ClpXP 단백질을 슬라이드 표면에 고정시킨 뒤, 목적 단백질의 특정 아미노산 기를 모두 다른 형광 염료로 표지하여 ClpXP 단백질이 목적 단백질의 서열을 카복실 말단에서부터 읽어 나가면서 분해하게 한다. ClpXP 단백질이 표지된 아미노산에 도달할 경우, ClpXP 단백질에 표지된 형광 분자와 표지된 아미노산의 다른 형광 분자 간에 FRET이 발생하여, FRET 신호를 관찰할 수 있다. ClpXP 단백질은 단백질 서열을 일정한 속도로 읽어나가면서 분해하므로 FRET 신호들 간의 간격을 통하여 표지된 특정 아미노산들 간의 상대적인 거리를 알 수 있고, 이 정보를 단백질 서열 분석에 대입할 수 있다.

2-3. 작용 사례 2: 단분자 공-면역침강을 이용한 신호전달 회로의 분석

또한 단분자 공-면역침강 기법을 많은 단백질-단백질 상호작용이 일어나는 신호전달 경로에 적용시킬 수 있음이 보고되었다. 첫 번째로, Ras와 Raf 단백질 간의 상호작용을 단분자 공-면역침강법을 이용하여 분석할 수 있었다 (8). mCherry로 표지된 HRas를 슬라이드 표면에 결합시킨 후, eGFP로 표지된 Raf를 유동 채널 내부에 넣어준다. Raf가 HRas와 상호작용할 시, 시간에 따른 eGFP 형광 신호 세기를 그래프로 그렸을 때 Ras와 Raf가 상호작용할 때 신호의 스파이크가 만들어진다. 이 스파이크의 너비가 수백 밀리초(ms)임을 통하여 Ras-Raf가 순간적으로 결합하였다가 다시 떨어지는 것을 볼 수 있었으며, 스파이크의 너비와 간격을 분석하여 Ras-Raf 상호작용의 동역학을 계산할 수 있었다. 이 방법을 확장하여 형광 단백질로 표지되지 않은 목적 단백질에도 적용시켜 볼 수 있었다. 암조직에서 얻은 돌연변이 Ras를 이용하여 Ras-Raf 간의 상호작용을 관찰하였을 때, 돌연변이 Ras는 Raf와 결합하는 정도는 정상 Ras에 비해 큰 차이가 없었으나, 활성화된 Ras의 비율이 더 높은 것을 볼 수 있었다.

두 번째로, 단분자 공-면역침강을 이용하여 암 내부에서 일어나는 다양한 신호전달 경로들을 프로파일링할 수 있다. 암에 치료에 있어서 가장 큰 어려움 중의 하나는 암이 불균일하다는 것으로, 같은 종류의 암에서도 환자에 따라, 또 세포에 따라 암세포들은 다양한 돌연변이들을 지니게 된다 (9,10). 이때 암세포의 표현형은 여러 신호전달 경로의 차이에 의해 나타나게 되는데, 신호전달 경로들의 특성상 여러 수용체들에 해당하는 경로들이 복잡하게 얽혀 있기 때문에 돌연변이가 일어나지 않은 경로라도 암세포의 생존과 발달에 영향을 미칠 수 있다 (11). 따라서 암세포에서 나타나는 신호전달 경로 내의 PPI를 분석할 수 있다면, 환자에 따라 암세포의 신호전달 경로의 차이를 분석하고, 정확한 진단을 통해 환자에 맞는 항암제를 투여할 수 있을 것이다.

여러 가지 암에서 나타나는 다양한 PPI를 분석하기 위해 단분자 공-면역침강 이미징에 사용되는 유동 채널을 소형화하여 High-Throughput으로 결과를 얻을 수 있는 시스템을 만들 수 있었다 (12). 이 시스템을 이용하여 여러 종의 암 세포주에서 발현되는 HER Family에 속하는 수용체의 양과 신호전달 경로의 하류에 속하는 단백질들 간의 PPI를 분석하였다.

그림 3. High-Throughput 단분자 이미징 개요.

먼저 5종의 폐암 세포주들에서 EGFR과 하위 신호전달 단백질들(Grb2, PLCγ_SH2, p85α) 간의 PPI를 분석하였다. 이때 EGFR 유전자의 19번 엑손에 돌연변이가 생긴 세포주들의 경우 Grb2가 EGFR가 인산화되지 않아도 SH3 도메인을 통하여 EGFR과 상호작용하는 것을 볼 수 있었다. 또한 특정 암 세포주들에서 발현되는 돌연변이 EGFR에는 인산화가 일어나지 않아도 Grb2뿐만 아니라 GAPDH, HSP90α, MIG6 등의 단백질이 결합하며, gefitinib에 의해 이 PPI가 억제되는 것을 단분자 공-면역침강으로 볼 수 있었다. 따라서 돌연변이 EGFR에서는 인산화와 무관한 신호전달 경로가 존재하는 것을 확인할 수 있었고, 이러한 신호전달 경로를 통하여 암세포가 외부의 EGF 없이도 스스로 증식하는 과정에 관여할 것이라 생각된다.

이러한 결과를 EGFR Signaling에 적용하여, 폐암에 대한 아바타 마우스와 폐암 환자의 조직을 용해하여 용해물 내에서의 PPI를 분석하였다. 두 모델 모두에서 정규화된 EGFR PPI(총 Grb2, PLCγ_SH2, p85α- EGFR PPI/총 EGFR 양)가 Gefitinib에 의한 생장억제 정도와 높은 상관관계를 보임을 확인할 수 있었다. 따라서 High-Throughput 기술을 통하여 얻은 PPI를 암 진단의 바이오마커로 활용할 수 있다는 것을 보일 수 있었다.

3.      결론

단분자 면역침강 기법을 통해 단백질들의 복합체를 실시간으로 관측할 수 있기 때문에, 기존의 co-IP에서는 보지 못하는 분자들 간의 상호작용이 일어나는 일련의 과정을 정량적으로 분석할 수 있다. 따라서 최근 들어 초저온전자현미경(Cryo-EM) 기술을 통하여 구조가 밝혀지고 있는 세포 내부의 단백질 등으로 이루어진 분자 기계들의 구동 원리를 이 기술을 통하여 분석할 수 있을 것이다. 또한 올해의 노벨 생리의학상은 암 면역치료에서 핵심적인 타깃 분자들을 발견한 연구자들이 받게 되었는데, 암 치료에 있어서 최근 다른 치료법들에 비해 예후가 좋고, 부작용이 적은 면역항암제가 각광을 받고 있다. 하지만, 면역항암제는 암의 종류나 환자에 따라 효과가 다양하다는 문제가 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해서는 암세포와 면역계에서 일어나는 복잡한 신호전달 과정을 분석하고 개인마다의 차이점을 분석해야 하는데, 단분자 공-면역침강 기술을 통하여 다양한 단백질 간의 상호작용이 관여하는 이 과정을 정량적으로 분석할 수 있을 것이다.

4.      참고문헌

1.       Aggarwal, V., & Ha, T. (2014). Single‐molecule pull‐down (SiMPull) for new‐age biochemistry: Methodology and biochemical applications of single‐molecule pull‐down (SiMPull) for probing biomolecular interactions in crude cell extracts. Bioessays 36(11), 1109-1119.

2.       Lee, H. W., Ryu, J. Y., Yoo, J., Choi, B., Kim, K., & Yoon, T. Y. (2013). Real-time single-molecule coimmunoprecipitation of weak protein-protein interactions. Nature protocols 8(10), 2045.

3.       Jain, A., Liu, R., Ramani, B. et al. (2011). Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down. Nature 473(7348), 484.

4.       Yeom, K. H., Heo, I., Lee, J., Hohng, S., Kim, V. N., & Joo, C. (2011). Single‐molecule approach to immunoprecipitated protein complexes: insights into miRNA uridylation. EMBO reports 12(7), 690-696.

5.       Jain, A., Arauz, E., Aggarwal, V., Ikon, N., Chen, J., & Ha, T. (2014). Stoichiometry and assembly of mTOR complexes revealed by single-molecule pulldown. Proceedings of the National Academy of Sciences 111(50), 17833-17838.

6.       Clatot, J., Hoshi, M., Wan, X., Liu, H., Jain, A., Shinlapawittayatorn, K., ... & Deschênes, I. (2017). Voltage-gated sodium channels assemble and gate as dimers. Nature communications 8(1), 2077.

7.       van Ginkel, J., Filius, M., Szczepaniak, M. et al. (2018). Single-molecule peptide fingerprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences 115(13), 3338-3343.

8.       Lee, H. W., Kyung, T., Yoo, J. et al.(2013). Real-time single-molecule co-immunoprecipitation analyses reveal cancer-specific Ras signalling dynamics. Nature communications 4, 1505.

9.       Kandoth, C., McLellan, M. D., Vandin, F. et al. (2013). Mutational landscape and significance across 12 major cancer types. Nature, 502(7471), 333.

10.      Meacham, C. E., & Morrison, S. J. (2013). Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature 501(7467), 328.

11.      O'Neil, N. J., Bailey, M. L., & Hieter, P. (2017). Synthetic lethality and cancer. Nature Reviews Genetics 18(10), 613.

12.      Lee, H. W., Choi, B., Kang, H. N., et al. (2018). Profiling of protein–protein interactions via single-molecule techniques predicts the dependence of cancers on growth-factor receptors. Nature Biomedical Engineering 2(4), 239.