생화학분자생물학회

hnRNPA2B1 표적 신규 항암물질 MO-2097 개발

HIF-1α inhibition by MO-2097, a novel chiral-free benzofuran targeting hnRNPA2B1

J. Adv. Res. 64, 67-81 (2024)​

성낙균 : 한국생명공학연구원 (soungnak@kribb.re.kr)

이경 : 동국대학교 (kaylee@dongguk.edu)

한호진 : 한국생명공학연구원

애니쉬 : 동국대학교

연구배경

 한국인의 가장 큰 사망원인은 악성 신생물(암) 이며, 이러한 암중 70~80 퍼센트를 차지하는 고형암은 단단한 모양을 하고 있는 악성종양이 폐, 간, 대장 등 여러 조직에서 발병하는 암종류이다(1).

 암 치료에는 수술, 항암화학요법, 방사선치료 등 다양한 방법이 시도되어 과거에 비해 크게 예후가 개선된 암도 있지만, 여전히 여러 종류의 암에서 전이, 재발, 항암제 내성, 항암제 부작용 등의 문제로 치료의 한계가 있다(2).

고형암의 경우 암이 체내에서 성장하는 동안 종종 암의 중심부에 혈관이 제대로 형성되지 않아 산소공급이 부족해지며, 이로 인해 저산소증이 발생한다. 이러한 저산소 상황에서 크게 영향을 받는 단백질이 HIF1-α 이다. HIF1-α 단백질은 산소가 풍부한 정상적인 상황에서는 자연스럽게 분해되지만, 산소가 부족한 상황에서는 분해되지 않고 남아 다양한 암세포의 대사, 전이 관련 단백질의 전사인자로서 작용한다(3). 이러한 저산소 상황에서 HIF1-α에 대한 내용의 연구로 2019년 William G. Kaelin Jr., Sir Peter J. Ratcliffe, and Gregg L. Semenz가 노벨상을 수상하였으며, HIF1-α의 조절을 통한 항암효과 및 치료제 개발에 대한 연구가 적극적으로 진행되고 있다.

HIF1-α 단백질을 표적으로 하여 간접적으로 단백질 자체의 발현을 억제하는 방법, 단백질의 mRNA를 조절하는 방법, 단백질의 전사기능을 저해하는 방법, 단백질의 안정성이나 다른 단백질과의 상호작용을 억제하는 다양한 방법이 있으나 현제 상용화된 약물은 없다(4).

선행연구를 통해 우리 연구실은 HIF1-α mRNA에 결합하여 mRNA를 안정화하여 단백질의 발현에 도움을 주는 hnRNPA2B1이라는 단백질을 발견하였고, 이를 표적하는 천연물질을 스크리닝하여 보고한바 있다. (Soung NK et al., 2019 EMM)(5). 하지만, 해당 약물의 경우 약효, 물성, 합성수율등의 문제로 동물실험 등 추가연구가 제한되었다. 특히 약물의 구조적 이성질체 형성은 약효를 매우 저해하는 작용을 하며 약물 개발의 힘겨운 부분 중에 하나였다. 이를 극복하고자 이번 연구를 진행하게 되었다.

연구내용

1. hnRNPA2B1 결합 최종 후보물질 도출 (MO-2097)

 기존 보고한 약물인 MO-460을 기반으로 7종류의 합성이 용이하고 구조적으로 안정적인 후보물질을 합성하였고 (그림1 A), 해당 약물들을 대상으로 제브라 피쉬에서 저독성을 행동실험을 통해 확인하였으며(그림 1B), 표적단백질인 hnRNPA2B1을 통한 하위 기전인 HIF1-α 억제 정도를 단백질 레벨에서 웨스턴 블롯으로 확인하여 최종 후보 물질인 MO-2097을 선정하였다. (그림 1 C)

그림 1. 다양한 종류의 hnRNPA2B1 후보물질 구조와 단백질 억제 정도 및 제브라 피쉬에서 독성평가

A. 다양한 신규 구조의 후보물질 구조그림

B. HIF1-α 억제 웨스턴 블롯

C. 제브라피쉬에 처리 후 생존여부 독성확인

D. 제브라피쉬에 처리 후 행동실험을 통한 독성여부 확인

2. MO-2097의 hnRNPA2B1과의 결합확인 및 기전 확인

최종 후보 물질로 선정한 MO-2097의 예상 표적단백질과의 결합을 확인하기 위해 E. coli에서 발현한 His-hnRNPA2B1과 MO-2097을 ITC(Isothermal Titration Calorimetry) assay 를 진행하였다. 해당 결과를 통해 Mo-2097과 hnRNPA2B1과의 직접 결합을 확인하였다 (그림 2A). 이후, RNA결합 단백질인 hnRNPA2B1의 주요 기능인 HIF1-α 의 mRNA안정성을 억제하는지 확인하기 위해 in vito transcription/translation을 진행하였다. 해당 결과를 통해 MO2097의 HIF1-α단백질 억제는 hnRNPA2B1을 통한 mRNA의 단백질로 전사를 방해함으로서 나타나는 것을 확인할 수 있었다. (그림 2B). 다음으로 전사인자인 HIF1-α의 억제를 통해 하위 유전자들의 발현을 억제하는지 확인하기 위하여 qPCR을 진행하였고, HIF1-α의 억제 뿐 아니라 하위 유전자인 HK1, MRP1, SLC1A5, IL6, VEGF 등 다양한 하부 기전의 억제를 확인하였으며, 이를 단백질 수준에서 검증하기 위해 HK1단백질을 웨스턴 블롯을 통해 확인하였고, 약물의 농도가 증가함에 따라 단백질량도 감소하는 것을 확인하였다. 이를 토대로 MO-2097은 hnRNPA2B1과 결합을 통해 HIF1-α의 mRNA를 억제하여 단백질 발현을 감소시키고 이를 통해 하부 유전자를 억제하는 약물 기전(mode of action)을 확인하였다. 

그림 2. MO-2097의 hnRNPA2B1과의 직접 결합 확인 및 기전연구

A. MO-2097과 E. coli에서 발현 후 정제한 His-hnRNPA2B1 단백질을 이용한 ITC assay

B. Transcription and Translation Assay를 통한 MO-2097의 HIF1-α 전사 억제 실험

C. qPCR을 통한 MO-2097을 통한 HIF1-α의 표적유전자들의 전사억제 확인

D. HIF1-α의 전사인자 기능 억제를 통한 표적 단백질 발현 감소 및 세포사멸 마커 확인

3.삼차원 (3D) 스페로이드 모델 및 동물모델에서 항암 효능 확인

 HIF1-α 단백질은 산소가 풍부한 정상적인 상황(21% 산소농도)에서는 단백질이 분해되지만 저산소 상황에서는 분해되지 않고, 발암 단백질로 역할을 하게된다. 우리는 앞선 결과를 통해 저산소 인큐베이터를 이용하여 인위적인 저산소 상황을 2D 세포에 주어지게 하여 MO-2097의 HIF1-α 억제 효과로 인해 항암 및 기전을 확인하였다. 실제 고형암의 경우 암이 커짐에 따라 자연스럽게 내부에 저산소 상황이 조성이 된다. 우리는 이러한 고형암의 조건인 3차원 구조와 자연적인 저산소 상황을 조성하기위해 3D 스페로이드를 장기간 배양하여 내부에 저산소 상황을 만들어 MO-2097의 항암 효능을 확인하였다. 3D 스페로이드에서 내부에 저산소 상황이 형성하는 것을 저산소 마커인 pimonidazole을 통해 검증 하였고, 우리 약물을 처리시 저산소가 형성된 스페로이드의 내부에서 특이적으로 항암효능을 나타냄으로 실제 고형암의 내부 저산소 환경에서 작용할 가능성을 확인하였다.  

그림 3. 3D 스페로이드에서 자연스러운 저산소 형성 후 MO-2097에 의한 표적항암효과 확인

이러한 항암효과를 마우스 제노그라프트 모델에서 검증하여 표적항암물질의 항암효능을 동물에서 검증할 수 있었다.

그림 4. 동물실험에서 MO-2097의 항암효능 확인

A. Balb/c nude 마우스에 대장암 세포주를 배양한 후 MO-2097의 처리 유무에 따른 항암효능 확인

B. 총 15일 간의 항암효능을 추적관찰

C. 최종 암의 무게 비교 

4. 환자 유래 대장암 오가노이드에서 표적 항암 효과 확인.

개인 맞춤형 치료법의 접근 방식으로 최근 크게 주목받고 있는 환자 유래 암 오가노이드를 이용하여 MO-2097의 항암 효능이 실제 암 환자에서도 동일한 기전으로 작용하는지 검증하고자 하였다. 그 결과, 대장암 환자 유래 암 오가노이드에서 MO-2097이 hnRNPA2B1을 억제하고, 이를 통해 HIF1-α 단백질과 HK1 단백질의 억제를 유도하는 것을 확인하였으며 환자 조직에서 교차 검증을 통해 HIF1-α의 발현량이 높은 환자에서 만들어진 오가노이드에서 발현량이 낮은 환자에서 만들어진 오가노이드보다 항암 효능이 크게 나타나며 HIF1-α의 억제도 더 낮은 농도에서 작용하는 것을 확인하여 실제 표적 항암물질로서의 가능성을 제안할 수 있었다.  

그림 5. 환자 유래 대장암 오가노이드에서 MO-2097의 항암 효능 확인 및 HIF1-α 단백질 억제 확인 

A. 4종류의 환자유래 암 오가노이드에서 MO-2097 처리 유무에 따른 항암 효능 현미경 확인

B. 각 오가노이드에서 약물 처리 후 세포 성장 마커 확인

C. 약효가 낮게 나타나는 1번 과 높게 나타나는 4번 환자의 오가노이드를 대상으로 HIF1-α 및 하부 기전 단백질을 웨스턴 블롯으로 확인

D. 1번과 4번 환자시료를 대상으로 HIF1-α 단백질 발현양 비교

연구 성과 및 의의

이번 연구를 통해 우리는 새로운 종류의 HIF1-α 단백질을 표적으로 하는 항암 물질을 개발하였으며, 해당 신약 후보 물질을 통해 고형암 치료에 새로운 가능성을 제시하였다. MO-2097은 hnRNPA2B1과의 결합을 통해 HIF1-α의 전사를 억제하고, 암세포의 대사와 전이 관련 유전자의 발현을 억제함으로써 항암 효과를 발휘하였다. 이를 통해 MO-2097이 고형암 치료에서 효과적인 표적 항암제로서의 잠재력을 지니고 있음을 확인하였다.

참고자료

1. Jung, Kyu-Won, et al. "Prediction of cancer incidence and mortality in Korea, 2023." Cancer research and treatment: official journal of Korean Cancer Association 55.2 (2023): 400-407.

2. Miller, Kimberly D., et al. "Cancer treatment and survivorship statistics, 2022." CA: a cancer journal for clinicians 72.5 (2022): 409-436.

3. Mukherjee, Sukhes, and Jagat Rakesh Kanwar, eds. Hypoxia in cancer: significance and impact on cancer therapy. Springer, 2023.

4. Bui, Bich Phuong, et al. "Hypoxia-inducible factor-1: a novel therapeutic target for the management of cancer, drug resistance, and cancer-related pain." Cancers 14.24 (2022): 6054.3

5. Soung, Nak-Kyun, et al. "Mechanism of the natural product moracin-O derived MO-460 and its targeting protein hnRNPA2B1 on HIF-1α inhibition." Experimental & Molecular Medicine 51.2 (2019): 1-14.​