생화학분자생물학회

CAR 구조에서 Transmembrane Domain의 역할과 기능적 중요성

이승아: 한림대학교 (audri01@naver.com​)​

오상욱: 한림대학교 (swoh@hallym.ac.kr)​

1. 서론

Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T 세포치료제는 항원 특이적 T 세포를 체외에서 재프로그래밍하여 종양세포를 제거하는 방식으로, 기존 항암 치료에 반응하지 않던 혈액암 환자들에게서 높은 완전관해율을 달성하며 주목받고 있다 (1, 2). CAR는 기본적으로 항원을 인식하는 single-chain variable fragment (scFv), 이를 유연하게 연결하는 hinge 또는 spacer, 세포막을 관통하는 transmembrane domain (TMD), 그리고 세포내에서 활성화를 매개하는 signaling module(CD28 또는 4-1BB와 같은 costimulatory domain과 CD3ζ)을 포함한다 (그림 1).

CAR의 각 요소가 CAR-T 세포의 특이성, 안정성, 그리고 활성 기능을 결정한다. 먼저, scFv는 CAR의 가장 앞부분에 위치하며 표적 항원과 직접 결합하는 역할을 한다. 이 도메인은 항체의 가변부 두 개를 하나의 사슬로 연결한 형태로, CAR-T 세포가 어떤 세포를 인식하고 공격할지를 규정하는 핵심 요소다. scFv 뒤에 위치한 hinge 또는 spacer 영역은 항원 결합 부위를 세포막으로부터 적절히 떨어뜨려 주어 유연성을 확보하게 한다. 이를 통해 epitope의 위치에 따라 scFv가 충분한 접근성과 회전 범위를 갖도록 도와 CAR의 결합 효율을 높인다. 세포막을 관통하는 TMD(transmembrane domain)는 CAR 구조를 세포막에 안정적으로 고정시키는 역할을 하고 있다. 마지막으로 세포 내부의 signaling module은 costimulatory domain(CD28 또는 4-1BB 등)과 CD3ζ로 구성되며, CAR 자극 후 T 세포 활성화, 증식, 생존, 피로도, 지속성 등 전반적인 기능적 특성을 결정한다. 특히 CD3ζ는 T 세포 활성화를 유도하는 기본 신호를 제공하고, costimulatory domain은 CAR-T의 장기적인 기능 유지와 반응 강도를 조절하는 데 중요한 역할을 한다.

초기 연구에서는 scFv의 항원 친화도 또는 co-stimulatory domain의 선택이 CAR-T의 치료 효과를 결정짓는 가장 중요한 요소로 여겨졌다 (3). 그러나 최근 연구들은 TMD가 단지 CAR을 막에 고정시키는 수동적인 구조물이 아니라, CAR의 안정성, 발현 수준, 세포 신호전달 강도 및 endogenous 수용체와의 상호작용까지 조절하는 능동적인 조절자 역할을 수행한다는 점을 분명히 보여주고 있다 (4, 5). 특히 동일한 scFv를 사용하더라도 TMD 선택에 따라 CAR-T 세포의 활성화 패턴, 증식 지속성, cytokine 분비 강도, 표면 발현 수준 등이 달라질 수 있음이 보고되면서, TMD는 더 이상 부속적 요소가 아니라 CAR 설계의 핵심 변수로 인식되고 있다.

그림 1. 표적을 인식하고 공격 신호를 보내는 CAR의 핵심 요소들

2. 본론

2-1. Transmembrane Domain의 구조적 특징과 CAR 배치 조절

CAR의 TMD는 약 20~25개의 hydrophobic amino acid로 구성된 단일 α-helix 구조를 형성하며, 이는 CD8α와 CD28, (일부에서는 CD4) 등의 단백질에서 유래하는 경우가 많으며, 일부 연구에서는 CD3ζ 유래 TMD도 사용된다. 그러나 이 단순한 α-helix는 아미노산 조성에 따라 서로 다른 구조적·기능적 특징을 갖게 된다 (6).

예를 들어, CD28 유래 TMD는 극성 아미노산과 helix 간 상호작용을 유도하는 잔기를 포함하고 있어, CAR이 endogenous CD28과 직접적으로 heterodimer를 형성하도록 유도할 수 있다 (7). 이러한 상호작용은 CAR clustering을 증가시키고 신호전달 복합체의 공간적 배열을 바꾸어 활성화 신호를 강화하는 방향으로 작용한다. 반면, CD8α TMD는 비교적 순수한 hydrophobic helix로 이루어져 있어 endogenous 수용체와의 특이적 결합을 거의 유도하지 않으며, CAR 분자가 단독 또는 느슨한 self-association 형태로 존재하도록 만든다.

즉, TMD의 아미노산 조성과 배열은 CAR이 세포막 내부에서 어떻게 배열되고, 어떤 단백질과 상호작용하며, 어떤 수준으로 oligomerization을 이루는지를 결정하는 핵심 구조적 변수라 할 수 있다.

2-2. CAR 신호전달에서 TMD의 기능적 역할

TMD는 CAR이 항원 결합 후 얼마나 빠르고 강하게 신호를 전달할지 결정한다. CD3ζ의 TMD는 endogenous TCR–CD3 복합체와 결합할 수 있는 특징을 가지는데, 이 경우 CAR-T는 TCR의 민감도를 공유하게 되어 항원 자극에 대한 반응 역치가 낮아지고 초기 활성화가 증폭되는 경향을 보인다 (8). 반면, CD8α TMD를 사용하는 CAR은 이러한 상호작용이 없어 보다 독립적인 신호전달 체계를 유지한다.

또한, CD28 TMD를 사용하는 CAR에서는 endogenous CD28과의 결합으로 인해 IL-2 및 IFN-γ와 같은 cytokine 분비가 증가하는 경향이 보고되었다 (9). 이는 초기 항종양 반응을 강하게 유도하지만, 동시에 지속적 자극에 따른 T 세포 피로(T cell exhaustion) 또는 과도한 cytokine release syndrome(CRS) 발생 위험을 증가시킬 수 있다. 반대로 CD8α TMD는 상대적으로 완만하고 안정된 활성화 패턴을 유도하여, CAR-T 세포의 장기적 생존(persistence)을 촉진하는데 유리하다 (10).

즉, TMD는 단순히 세포막을 통과하는 구조적 연결 부위 뿐만 아니라 CAR-T가 “빠르게 강하게 반응하는 세포”가 될지, 아니면 “천천히 지속적으로 반응하는 세포”가 될지를 결정하는 반응 성향(response phenotype)을 규정하는 조절 스위치의 역할도 수행할 수 있다.

2-3. CAR 표면 발현 안정성과 TMD의 영향

TMD는 CAR이 세포 표면에서 얼마나 오래 유지되는지에도 영향을 미친다 (11). Fujiwara 등은 CD4, CD8α, CD28에서 가져온 hinge와 TMD가 CAR의 표면 발현을 어떻게 조절하는지 분석했다 (4). VEGFR2-특이적 CAR를 도입한 T 세포에서 CD8α 또는 CD28 유래 hinge–TMD를 사용한 경우, CD3ζ나 CD4에서 가져온 hinge–TMD를 사용했을 때보다 CAR 표면 발현이 더 높게 나타났다. 비슷한 결과는 NKp30 CAR에서도 관찰되었는데, CD3ζ TMD보다 CD8α 또는 CD28 TMD를 사용할 때 CAR의 표면 발현이 더 우수했다 (12). 이러한 결과들은 hinge와 TMD가 CAR의 표면 안정성을 유지하는 데 중요한 역할을 한다는 점을 말해 준다.

이와 같은 TMD 의존적 발현 차이는 우리 연구팀이 개발한 chimeric autoantibody receptor (CAAR)-T 에서도 일관되게 관찰되었다. 항체 기반 scFv로 표적을 인식하는 CAR와 달리, CAAR는 자가항원을 수용체로 사용함으로써 병원성 B세포만을 선택적으로 제거할 수 있다는 장점이 있다 (그림 2). 중증근무력증(myasthenia gravis) 환자를 치료하기 위해 AChR-CAART를 개발하는 과정에서, 동일한 세포 및 배양 조건에서 CD8α TMD를 적용한 AChR-CAAR는 ex vivo 확장 과정 동안 표면 발현이 점차 감소한 반면, CD28 TMD를 적용한 AChR-CAAR는 발현 수준이 안정적으로 유지되는 것을 발견하였다 (5). 이러한 경향은 단순 시험관 수준을 넘어 in vivo NSG 마우스 모델에서도 재현되었으며, CD28 TMD를 포함한 CAAR가 장기간 높은 발현을 유지하는 것이 확인되었다.

아직 정확한 분자적 기전은 완전히 밝혀지지 않았지만, 이러한 결과들은 TMD가 CAR과 CAAR 모두에서 표면 발현 안정성(surface expression stability)을 결정하는 핵심 구조적 요소임을 시사한다. 이러한 차이는 단순히 CAR 발현의 양적 차이를 넘어, 세포가 항원을 인식할 수 있는 순간적 기회 그 자체를 조절한다. 표면 CAR의 수가 많을수록 T 세포가 종양세포를 인식할 확률과 신호전달 강도는 증가하며, 이는 결국 CAR-T 치료의 효과와 직결된다.

그림 2. 나쁜 항체만 선택적으로 제거해 면역을 보호하는 CAAR-T 치료

2-4. Transmembrane Domain의 설계 및 최적화 전략

최근 CAR 엔지니어링에서는 scFv와 co-stimulatory domain 중심의 전통적인 설계 요소를 넘어, transmembrane domain(TMD) 자체를 기능적 조절의 핵심 모듈로 활용하려는 시도가 빠르게 증가하고 있다 (6). TMD는 단순히 CAR이 세포막을 관통하도록 고정하는 구조 요소에 그치지 않고, 신호전달 복합체의 배치, CAR의 표면 발현 안정성, oligomerization 정도, endogenous receptor와의 상호작용 등 다양한 생물학적 변수에 직접적 영향을 미친다는 사실이 점점 더 명확해지고 있다. 이에 따라 최근 연구들은 TMD를 전략적으로 재설계하여 CAR의 반응 강도와 지속성, 독성 프로파일을 조절하고자 한다.

첫 번째 전략은 co-stimulatory domain과 동일한 기원을 가진 TMD를 조합하는 방식이다. 예를 들어 ICOS 기반 co-stimulatory domain과 ICOS TMD의 조합이 보다 안정된 신호 특성을 유도할 수 있다는 전임상 데이터가 제시된 바 있다 (13). 이는 구조적 기원과 기능적 기원이 일치할 때 TMD–signaling module 사이의 공간적 배치(orientation)가 최적화되어 CAR clustering, 시냅스 형성, sustained signaling이 조화롭게 유지되기 때문으로 해석된다. 즉, TMD는 co-stimulatory domain이 세포내에서 어떤 방향으로 배열되고 어떤 단백질들과 근접하게 위치할지를 결정하는 물리적 기반을 제공하는 것이다.

두 번째 전략은 endogenous receptor와의 불필요한 상호작용을 제거하는 변형(modification) 전략이다. 대표적으로 CD28 TMD 내 특정 극성 잔기는 endogenous CD28과 상호작용하여 CAR-T 세포에서 예기치 않은 tonic signaling 또는 과도한 cytokine 분비를 유도할 수 있는 것으로 알려져 있다 (14). 이러한 잔기를 point mutation 형태로 비극성 잔기로 치환하면, CAR이 endogenous CD28과 이합(dimerize)하거나 hetero-oligomerize되는 현상을 억제할 수 있으며, 그 결과 불필요한 활성화가 줄어들고 전반적인 독성 위험이 감소한다. 이는 TMD가 단순 고정 요소가 아니라, CAR이 세포막 내에서 어떤 파트너 단백질과 상호작용할지를 결정하는 기능적 도메인임을 보여준다.

세 번째 전략은 de novo protein design을 이용한 TMD oligomerization 조절 기술이다. 최근 단백질 설계 알고리즘(RFdiffusion, AlphaFold 기반 설계, helix-tilt engineering 등)을 활용하여 TMD의 coiled-coil 형성 능력이나 helix packing 각도를 정밀하게 조절하는 연구가 등장하고 있다 (6). 이러한 접근은 이론적으로 CAR 신호도 ‘dialable’하게 조절할 수 있는 가능성을 제시하며, 실제 CAR 시스템에 이를 적용하려는 시도가 점차 보고되고 있다. 즉, TMD의 이합체 형성 능력 또는 trimerization 정도를 바꾸면, CAR clustering의 강도와 면역시냅스 내 신호 증폭 정도를 조절할 수 있으며, 이를 통해 tumor-targeting CAR는 고강도 활성, autoimmune-targeting CAAR는 저자극 방식 등의 맞춤형 설계가 가능해진다. 이는 TMD를 단순한 구조적 관통 부위가 아닌 정밀한 신호 조절 장치(signaling rheostat)로 재해석하는 접근이다.

이러한 세 가지 전략은 모두 CAR의 전반적 기능, 발현 안정성, 활성화 패턴, 부작용 위험을 조정하는 데 있어 TMD가 매우 중요한 설계 축(design axis)임을 보여준다. 앞으로는 costimulatory domain 중심의 구분뿐 아니라, TMD의 기원과 구조적 특징을 조합한 복합적 설계를 통해 보다 세밀하고 안전한 차세대 CAR 및 CAAR 개발이 가능해질 것으로 기대된다.

3. 임상적 함의

CAR-T 치료제의 임상적 반응 특성과 독성은 주로 costimulatory domain에 의해 결정되는 것으로 알려져 있다. 실제로 CD28 기반 CAR는 빠르고 강한 초기 확장을 유도하는 반면, 4-1BB 기반 CAR는 완만하지만 장기간 지속되는 활성화를 특징으로 한다. 그러나 FDA 허가를 받은 대표적인 CD19 CAR-T 치료제인 Yescarta와 Kymriah의 구조를 비교해 보면, costimulatory domain 외에도 transmembrane domain(TMD) 구성의 차이가 임상적 차이를 부분적으로 설명할 수 있다는 점도 주목할 필요가 있다 (2, 15).

Yescarta(Axicabtagene ciloleucel)는 CD28 costimulatory domain과 함께 CD28 TMD를 사용하는 구조를 가지고 있다. 이 치료제는 LBCL 환자를 대상으로 한 ZUMA-1 연구에서 매우 빠른 초기 세포 확장과 높은 전체 반응률을 보였으며, CRS 발생률은 93% (94/101), ≥Grade 3 CRS는 13%(37% Grade 1, 44% Grade 2, 9% Grade3, 3% Grade 4, 1% Grade 5)로 보고되었다 (16). 투여 후 2일 내 CRS가 시작되고 약 일주일 이상 지속되는 등, 빠른 면역 활성화 패턴과 높은 염증 반응이 구조적 설계 요소와 연관되어 있을 가능성이 제기된다. 이러한 임상적 특성은 CD28 costimulation의 영향이 가장 크지만, CD28 TMD가 CAR의 표면 발현 안정성, tonic signaling, 면역시냅스 형성 효율 등에 영향을 주었을 가능성도 완전히 배제할 수 없다.

반면 Kymriah(Tisagenlecleucel)은 4-1BB costimulatory domain을 사용하며, CD8α TMD를 포함한 CAR 구조를 가지고 있다. 문헌에 따르면 4-1BB 기반 CAR는 CD28 기반 CAR에 비해 세포 확장이 느리지만 더 오랫동안 체내에서 유지되는 특징이 있다 (17, 18). 4-1BB 기반 CD19 CAR-T(예: Kymriah 및 동일 계열 제품)는 환자에서 수개월에서 수년, 일부 연구에서는 10년 이상까지 장기적으로 검출된 사례가 보고되어 있으며, 이는 지속적 완전반응을 유지하는 데 기여하는 것으로 보고된다 (19, 20). 또한 CRS 발생률은 상대적으로 낮은 경향을 보이며, 전반적인 독성 프로파일이 완만한 편이다. 이러한 임상적 특성 역시 costimulation의 영향이 가장 크지만, CD8α TMD가 CAR의 멤브레인 안정성, 발현 지속성, 내부화 속도 등에 기여했을 가능성이 있다.

4. 결론 및 Perspective

이 두 치료제의 비교는 중요한 시사점을 제공한다. 임상 반응의 주요 결정 인자는 costimulatory domain이지만, TMD 역시 그에 독립적으로 CAR의 표면 발현 안정성, 세포 확장 패턴, 독성 프로파일 등에 영향을 줄 수 있는 구조적 변수라는 점이다. 특히 최근 연구뿐 아니라, 우리 연구팀이 개발한 AChR-CAART에서 CD28 TMD는 ex vivo 및 in vivo에서 발현을 안정적으로 유지시킨 반면 CD8α TMD는 발현 저하를 보였다는 점은, TMD가 CAAR에서도 기능적으로 중요한 요소임을 뒷받침한다.

결국 TMD는 단순한 “막 관통 부위”가 아니라, costimulation과 함께 CAR-T 치료제의 전체적 생물학적 동작과 임상적 동작을 조정하는 세밀한 설계 파라미터이다. 따라서 새로운 CAR 또는 CAAR 개발 시, scFv와 costimulatory domain 선택뿐 아니라 TMD의 선택 역시 기능적 미세 조정을 위한 중요한 전략적 요소로 고려되어야 할 것이다.

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