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지질단백질 관련 포스포리파제 A2 억제제 Darapladib이 지질 대사를 재구성하여 암세포를 페롭토시스에 민감하게 만든다는 연구
작성자
오미희 (한국생명공학연구원), 이은우 (한국생명공학연구원)작성일자
2024-07-10조회수
2183지질단백질 관련 포스포리파제 A2 억제제 Darapladib이 지질 대사를 재구성하여 암세포를 페롭토시스에 민감하게 만든다는 연구
The lipoprotein-associated phospholipase A2 inhibitor Darapladib sensitises cancer cells to ferroptosis by remodelling lipid metabolism
Nat Communications 14, 5728 (2023)
오미희 : 한국생명공학연구원 책임연구기사 (ohmihee@kribb.re.kr)
이은우 : 한국생명공학연구원 선임연구원 (ewlee@kribb.re.kr)
연구배경
페롭토시스는(Ferrotosis) 철 의존성 세포사멸이라는 의미로 비교적 최근에 명명된 세포사멸이다(1). 페롭토시스의 가장 중요한 특징은 세포막의 과도한 지질과산화(Lipid peroxidation)의 축적이며 지질과산화는 유리라디칼 연쇄반응을 통해 지질 활성산소(Lipid ROS)를 발생시켜 세포막을 직접 파괴함으로써 세포사멸을 유도하게 된다(2, 3). 정상적인 세포 내에서는 글루타티온(GSH) 과산화효소인 Glutathione Peroxidase 4 (GPX4)에 의해 과산화지질이 무독성 지질 알코올로 환원되어 세포의 생존을 유지하게 된다(2, 3). GSH는 GPX4에 의해 동시에 산화되므로 GPX4의 필수 보조 인자 역할을 한다. 시스테인, 글루타메이트, 글리신으로 구성된 GSH의 세포 내 수준은 주로 시스틴-글루타메이트 역수송체에 의해 조절된다.(그림 1) 이를 바탕으로 GPX4 또는 시스틴-글루타메이트 항포터를 표적으로 하는 여러 가지 페롭토시스 유도제 (FIN)가 개발되었으며 암 치료를 위한 잠재적인 약물로 간주되고 있다(4). GPX4/GSH 시스템은 대부분의 유형의 세포를 페롭토시스로부터 보호하지만, 최근 연구에 따르면 중간엽 특성을 가진 화학 저항성 암세포 또는 약물 내성 암세포는 특히 페롭토시스에 취약한 것으로 나타났다(5). 따라서 페롭토시스는 새로운 항암 치료 전략으로 널리 인식되어 왔다.
페롭토시스는 지질 과산화에 의해 유발되므로 지질 대사, 철 대사, 항산화 경로 등 지질 과산화에 영향을 미치는 다양한 대사 및 신호 전달 경로가 페롭토시스 경로에 관여한다(2). 다양한 불포화지방산 중에서 특히 포스파티딜에탄올아민(Phosphatidylethanolamine; PE)에 결합한 아라키돈산(Arachidonic acid; AA, C20:4n-6)과 아드렌산(Aderenic acid; AdA, C22:4)에서 과산화가 많이 발생하며, 이는 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다(6, 7). 다양한 병리학적 맥락에서 페롭토시스에서 AA가 PE 또는 PC로 통합되는 것을 중재하는 ACSL4 (acyl-CoA synthetase 4)와 LPCAT3 (lysophospholipid acyltransferase)의 중요한 역할이 상당한 연구의 초점이 되어 왔다(2).
그림 1. 페롭토시스 경로 및 유도 약물
포스포리파제 A2(PLA2)는 인지질의 sn-2 위치에서 지방산을 가수분해하는 효소이며, PLA2 수퍼패밀리에는 50개 이상의 효소가 존재한다(8). PLA는 크게 분비성 PLA2(sPLA2), 세포질 PLA(cPLA2), Ca2+ 비의존적 PLA2(iPLA2), 지질단백질 관련 포스포리파제 A2(Lp-PLA2)로 분류되며, PLA2G7에 의해 암호화되고 혈장 혈소판 활성화 인자 아세틸하이드롤라제[PAF -AH])로 알려져 있으며, 모두 서로 다른 서열과 구조를 가지고 있다(9). PLA2의 주요 역할은 막 인지질에서 AA를 추출하여 프로스타글란딘(prostaglandin), 류코트리엔(leukotriene) 및 리소인지질(lysophospholipid)과 같은 병리생리학적 지질 매개체의 형성에 기여하는 것이다. AA는 페롭토시스에서 중요한 역할을 하기 때문에 PLA2는 페롭토시스에 관여하는 것으로 생각된다. cPLA2는 AA를 방출하여 과산화지질을 증가시키는 것으로 이미 알려져 있지만, 페롭토시스에 대한 기여는 불분명하다(10). PLA2G6에 의해 인코딩된 iPLA2β는 최근 AA(15-HpETE-PE)를 포함하는 산화된 PE를 특이적으로 절단하는 것으로 확인되었으며, 이는 페롭토시스를 억제한다고 보고되었다(11).
연구결과
항암 내성 군의 탁월한 세포사멸 기전인 페롭토시스와 관련된 암 대사를 이해하기 위해,대사 약물과 페롭토시스 유도제 RSL3를 단독 혹은 병용 처리한 결과, 다라프라딥(Darapladib)이 낮은 농도의RSL3와의 병용처리 군에서 세포 대부분이 사멸하였고 페롭토시스 저해제를 함께 처리하였을 때 세포사가 확연히 감소함을 확인하였다(그림 2). 다라프라딥의 표적 단백질은 Lp-PLA2 (lipoprotein associated phospholipase A2, 지질단백 연관 인산지질분해효소 A2)이며 Lp-PLA2는 주로 세포 외부에서 지질단백질과 결합하여, 특히 산화된 지질단백질(oxLDL)의 산화 인지질을 분해한다. 이 과정에서 산화된 비에스테르화 지방산(oxNEFA)과 라이소인지질(lysoPC)이 생성되는데, 이는 관상동맥 질환을 악화시키는 것으로 알려져 있다. 다라프라딥은 급성 및 만성 관상동맥 질환 치료를 목적으로 임상 3상 시험까지 수행했으나, 결국 실패했다 (12).
그림 2. (A) 403개의 대사약물들과 페롭토시스 유도제인 RSL3의 병용처리에 따른 세포 생존률 비교 결과 (B) Hs746T와 SNU484세포에 RSL3와 다라프라딥 병용처리후 세포이미지
위의 결과를 검증하기 위해 다라프라딥과 여러 종류의 페롭토시스 유도제를 병용 처리하였고 그 결과 세포사가 크게 증가함이 관찰되었고, 시스테인 결핍조건에서 다라프라딥 처리만으로 세포사가 크게 증가함을 확인하였다. 또한, 페롭토시스의 가장 큰 특징인 지질과산화를 보이는 세포의 비율의 RSL3와의 병용처리조건에서 높은 수준으로 증가함을 확인하였다(그림 3).
그림 3. (A) 시스테인 결핍조건에서 다라프라딥 처리 후 세포 생존율 비교 (B와 C) Hs746T와 SNU484세포에 RSL3와 다라프라딥 병용 처리후 지질 과산화정도 측정한 그래프 (B)와 염색된 세포 이미지 (C)
이후 다라프라딥이 어떻게 페롭토시스에 기여하는지 조사해보고자 하였고 이를 위해 가장 먼저 확인한 것은 Lp-PLA2 의존적 방식으로 세포를 페롭토시스에 민감하게 만드는지 확인해 보았다. Lp-PLA2는 지질단백질과의 상호작용이 알려져 있으므로(13), 우리는 먼저 지질단백질이 결핍된 상태에서 다라플라딥의 효과를 테스트해보았다. 그 결과 혈청 안 지질단백질의 부재 조건에서도 페롭토시스를 촉진함을 확인하였고 추가적으로 무혈청 조건에서도 페롭토시스를 촉진함을 확인하였다(그림 4). 이 후 페롭토시스의 유도제와 다라프라딥의 단독 혹인 병용처리 조건에서 페롭토시스의 잘 알려진 조절인자들의 발현 및 세포 내 철 이온의 수준을 조사해 보았지만 유의미한 차이가 없음을 확인하였다.
그림 4. (A와 B) Hs746T세포에서 리포단백질이 결핍된 혈청 (A)과 무혈청 (B)조건에서 RSL3와 다라프라딥 병용 처리후 세포생존률 비교
지질단백질과 세포 외 lysoPC는 다라플라딥의 작용에 필요하지 않음을 확인하였기 때문에 Lp-PLA2가 실제로 페롭토시스 경로와 연관되어 있는지 궁금했고 이를 위해 CRISPR-Cas9 시스템을 이용하여 유전자 녹아웃(KO)을 진행하였다. Lp-PLA2를 암호화하는 PLA2G7 유전자가 결손 된 위암 세포주는 페롭토시스 유도 약물에 민감성을 보임을 확인하였다(그림 5). 또한 시스테인이 결핍된 조건에서는 야생형 세포는 생존력이 크게 감소하지 않았지만 PLA2G7 KO 세포는 급속한 세포 사멸을 겪었고 이는 Fer-1에 의해 회복됨을 관찰하였다.
그림 5. (A) 넉아웃 세포 제작 후 RSL3 처리하여 세포생존률 비교 (B) 지질과산화 정도 측정
Lp-PLA2는 세포 외 기질로 분비되고 지질단백질과 상호작용하는 것으로 알려져 있지만(14), 우리의 결과는 지질단백질이 다라플라딥에 의해 유도되는 페롭토시스 민감도에 필수적이지 않다는 것을 시사하였고 또한 이전의 여러 보고서에서 Lp-PLA2가 세포질에서도 발현하고 있음을 보고한바가 있으므로 우리는 실험을 통해 Lp-PLA2가 배지 뿐만 아니라 세포와 세포막 모두에 존재함을 관찰하였다(그림 6).
불포화지방산을 포함하는 인지질은 페롭토시스 민감도에 중요하기 때문에 세포내 Lp-PLA2가 세포의 지질 구성을 조절할 수 있다는 가설을 세웠고 지질대사체(Lipidome) 분석으로 PLA2G7 녹아웃 세포에서 PE는 증가했지만 LysoPE와 LysoPC는 감소하였고 특히, PE-38:4(18:0/20:4)와 같은 페롭토시스와 관련된 인지질이 풍부하다는 것을 확인하였다. 이로써 세포 내 Lp-PLA2가 인지질 구성을 조절함으로써 페롭토시스를 억제함을 밝혀내었다. 또한, 정상 세포에 다라프라딥을 처리하여 Lp-PLA2 활성을 억제한 후 지질대사체 분석을 하였을 때도 위의 결과를 다시 한번 확인할 수 있었다(그림 6).
그림 6. (A) Lp-PLA2과발현 후 상층액과 세포침전액에서 Lp-PLA2발현 확인 (B) Lp-PLA2과발현 후 세포질과 인지질막츨에서 Lp-PLA2발현 확인 (C와 D) 넉아웃세포주에서 지질대사체 분석 후 PE의 증가와 LysoPC, LysoPE 감소 확인
또한, 동위원소로 표지된 PE 인지질을 이용하여, 시험관 내에서 다라플라딥이 PE를 lysoPE와 불포화지방산으로 절단되는 것을 직접 억제함을 확인하였다(그림 7).
그림 7. 다라프라딥이 효율적으로 PE의 절단을 억제함을 확인한 결과(A)와 이를 화학 구조로 표현(B)
마지막으로 다라프라딥이 페롭토시스를 가속하여 페롭토시스를 유도 약물인 PACMA31 (GPX4 inhibitor)의 항종양 활성을 향상함을 확인하였다. 이로써 Lp-PLA2와 GPX4 모두의 억제는 생체 내에서 종양 성장을 상승적으로 억제함을 밝혔다(그림 8).
그림 8. (A와 B) 다라프라딥과 PACMA31의 병용투여에 의한 항종양 활성 확인
연구의 성과 및 의의
2022년 발표된 중앙암등록본부 자료에 의하면 위암은 2020년 전체 암 발생의 4위(10.8%)에 해당하며 여전히 상위권을 차지하고 있다. 여러 항암제의 개발에도 불구하고 여전히 위암은 약물로 치료하기 어려워 수술이 우선시 되고 있으며, 특히 암이 위의 점막하층을 지나 근육층 이상을 뚫고 들어간 진행성 위암의 경우 효과적인 치료제가 없는 상황이다. 이는 진행성 위암이 쉽게 전이되는 특성과 함께 기존 항암제에 내성을 가지며 재발하기 때문인데 이를 해결하기 위한 연구가 다양하게 진행되고 있지만, 여전히 많은 연구를 필요로 한 상황이다. 이에 최근 페롭토시스가 항암제 내성암을 비롯한 여러 난치성 암을 사멸시키는 새로운 경로로 주목받고 있다.
본 연구팀은 탁월한 세포사멸에 기전을 가진 페롭토시스를 항암치료제로 이용하기 위해 페롭토시스 유도제와 대사 약물을 혼합하며 최적의 조합을 찾기 위한 연구를 거듭한 결과, 페롭토시스 유도제와 다라플라딥조합이 항암제 내성암을 비롯한 여러 암을 효과적으로 사멸할 수 있음을 밝혀내었다.
페롭토시스 유도제와 병용처리에 관한 연구는 매우 미비한 상황이었으며, 특히 Lp-PLA2가 암세포 사멸에 관여하는 예는 알려지지 않았다. 또한 Lp-PLA2는 주로 세포 외부에서 지질단백질과 결합하여 지질단백질에 있는 인지질에 작용하는 것으로 알려져 있었지만 본 연구를 통해 Lp-PLA2가 세포 내의 특정 인지질의 대사를 조절할 수 있으며, 특히 다라플라딥 약물은 1시간 이내에 세포 내 지질 조성을 크게 변화시킬 수 있었는데, 이는 세포 내에서 인지질의 분해와 재합성 경로인 Lands Cycle이 평상시에도 빠르게 작동하고 있음을 암시한다 (15) (그림9). 따라서, Lp-PLA2 저해를 통한 인지질의 재편성은 페롭토시스에 유리한 지질 환경을 조성하여 페롭토시스를 이용한 세포사멸의 민감성을 증진시킬 수 있다는 것을 규명하여 새로운 항암 치료 전략을 제시한데에 의의가 있다.
그림9. 페롭토시스 경로에서 Lp-PLA2의 역할
(출처 : An integrated view of lipid metabolism in ferroptosis revisited via lipidomic analysis. Exp Mol Med 55, 2023)
참고문헌
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