생화학분자생물학회

프로탁 

(PROTAC; PROteolysis-Targeting Chimera) 

박광수

계명대학교 약학대학 약학과

parkks@kmu.ac.kr​ 

1. 서론

최근 항체신약 및 ADC(Antibody Drug Conjugate)를 포함한 다양한 신규 모덜리티(Modality)가 앞다투어 개발되고 있다. 그 이유는 현재 치료제들이 가지는 한계를 극복하기 위해서였다. 그동안 질병의 원인을 파악하기 위한 광범위한 노력이 이루어져 왔다. 특히, 유전체학과 인공지능의 만남으로 질병의 신규 표적의 발굴이 폭발적으로 이루어지고 있다. 그러나 그 표적을 면밀히 살펴보면 기존의 저분자 화합물로 표적하기 어려운 전사인사 및 비효소 단백질들을 대거 포함하고 있다. 이런 표적을 우리는 undruggable 표적이라 불러왔으며 기존의 치료제로는 표적하기 어려웠다. Undruggable 표적 단백질을 저분자 화합물로 표적하기 어려운 이유는 명확한 결합자리(binding site)가 존재하지 않기 때문이다. 저분자 화합물은 보통 occupancy-driven pharmacology 기전을 가지고 있기 때문에 충분히 좋은 결합력(binding affinity)를 가지고 있어야 표적 단백질에 잘 결합하여 저해능력을 보여줄 수 있다. 그러나 명확한 결합자리가 존재하지 않은 undruggable 표적 단백질에 대해서는 충분히 좋은 결합력을 확보하기가 어려워진다.  거대한 신규 모덜리티 개발 흐름은 기존의 치료제들의 한계를 극복하고 하는 연구자들의 생각에서 시작되었다. 다양한 신규 모덜리티 중에 표적 단백질을 분해하는 기술(Targeted Protein Degradation (TPD) technology) 역시 관심이 매우 뜨겁다. 현재 표적 단백질 분해 기술 역시 다양해져 프로탁(PROTAC), 분자접착제(molecular glue), 오토탁(AUTOTAC), 라이탁(LyTAC), 에텍(ATTEC) 등이 연구 개발되고 있다. 그 중에서도 프로탁과 분자접착제가 가장 많이 연구가 되었으며 현재 여러 분자들이 임상을 진행중이다.

표적 단백질 분해 기술 대부분은 저분자 화합물을 기반으로 이루어져 있고, 표적에 결합을 하지만 그 자체로 효과가 있는 것이 아니라 분자가 결합한 뒤 생체내의 단백질 분해 시스템을 이용하게 된다. 생체내의 단백질 분해 시스템은 크게 UPS(Ubiquitin Proteasome System)과 Autophagy 시스템으로 이루어져있다. 따라서 대부분의 표적 단백질 분해 기술은 위 두가지 시스템 중 하나를 이용하게 된다. 표적 단백질 분해 기술 중에 가장 많이 사용되고 있는 프로탁과 분자접착제는 UPS를 활용하여 표적 단백질을 분해하는 기술이다. 본 소식지에서는 표적 단백질 분해 기술 중 프로탁 기술을 중심 적으로 소개하고 앞으로의 연구 방향성에 대해서 필자의 생각을 기술하고자 한다.

​2. 본론

2-1. 프로탁 (PROTAC, Proteolysis-targeting chimera) 개발 역사

2001년, 예일대학교 화학과의 Craig M. Crews 교수와 공동연구자들이 프로탁의 개념을 증명하는 논문을 처음 보고하였다. 이때 당시 최초의 프로탁은 펩타이드 버전으로 설계가 되었으며, 분해하고자 하는 표적 단백질은 MetAP-2(methionine aminopeptidase-2)이 사용되었고 E3 ligase로는 transducin repeat-containing E3 ubiquitin–protein ligase(β-TRCP)가 사용되었다. 즉, MetAP-2에 결합하는 펩타이드 서열과 β-TRCP에 결합하는 펩타이드 서열을 연결하였더니 MetAP-2가 β-TRCP에 의해 ubiquitination이 일어난다는 것을 발견하였다. 현재 이와 같은 아이디어를 이용하여 bioPROTAC 이라고 하는 펩타이드 버전의 프로탁도 존재한다.

그러나 신규 표적 단백질에 결합하는 펩타이드를 발굴하는 일이 쉽지 않았고, 또한 긴 펩타이드 형태의 초기 프로탁은 약물학적으로도 불안정하고 물성도 좋지 않았다. 따라서 초창기 버전의 프로탁은 범용적으로 사용되지 못하였다. 프로탁이 폭발적인 인기를 끌며 다양한 표적단백질에 응용이 되기 시작한 시점은 VHL에 결합하는 저분자 화합물 리간드가 개발되었던 시점과 비슷한 시기에 CRBN을 새로운 E3 ligase로 활용을 하면서부터이다. 

프로탁을 고안하였던 Craig M. Crews 교수와 함께 그때 당시 Cambridge 대학에 있었던 Alessio Ciulli 교수(현재는University of Dundee)가 Hippel–Lindau tumour suppressor (VHL)에 결합하는 펩타이드를 기반으로 저분자 화합물을 2012년도에 개발하였다. 이렇게 개발된 VHL 리간드를 이용하여 2015년도에 BRD4를 분해하는 첫 VHL 기반 저분자 프로탁 (MZ1)이 만들어졌다. 비슷한 시기인 2014년에 James E. Bradne와 공동연구자들은 E3 ligase인 cereblon(CRBN)에 결합할 수 있는 리간드인 phthalimides 골격을 보고하고 2015년에 phthalimides 골격을 기반으로 한BRD4 표적 CRBN 기반 프로탁(dBET1)을 보고하였다. 이 두 상징적은 프로탁을 기점으로 현재까지 6111개의 프로탁이 만들어진 것으로 추정되며 (PROTAC-DB 3.0 기준) 20개 정도의 프로탁 약물이 임상에 들어가 있다. 그 중 가장 임상에서 리딩하고 있는 약물은 아비나스사의 ARV-471(Vepdegestrant)로 현재 임상 3상을 진행 중에 있다. 현재 대부분의 임상은 항암 표적으로 진행되고 있으나 최근 퇴행성 뇌질환, 면역질환 등으로 임상의 영역을 확장하려는 시도가 있다.

그림1. 프로탁 개발의 주요 타임라인 (참고문헌 5에서 발췌) 

2-2. 프로탁 개념 

프로탁은 표적 단백질의 분해를 유도하는 저분자 화합물로  프로탁 약물은 일반적으로 그림 2 처럼 구성되어 있으며, 각각 다른 기능을 하는 리간드를 링커를 통해 연결한 하나의 저분자 화합물(heterobifunctional small molecules)이다. 질병 유발 단백질에 결합하는 리간드(Warhead)와 단백질 분해 유도를 위해 필요한 E3 리가아제(E3 ligase)에 결합하는 리간드와 이를 연결한 링커(Linker)로 구성되어 있다 (그림 2).

그림2. 프로탁의 구성 요소 (참고문헌 7에서 발췌)

표적 단백질에 결합하는 리간드는 warhead라고 불리우며 분해하고자 하는 단백질과 결합 친화성(binding affinity)가 있는 화합물이 사용된다. 특징적인 점은 프로탁을 설계할때는 단백질의 기능을 저해할 수 있는 화합물(저해제) 뿐만 아니라, 기능 저해를 유발하지 않더라도 표적 단백질과 결합 친화성이 있는 화합물 역시 프로탁의 warhead로 활용이 가능하다. 그렇기 때문에 프로탁 기술을 응용하여 RNA 등 단백질이 아닌 표적도 선택적으로 분해 유도가 가능함이 보고되고 있다.

E3 ligase는 약 600여개가 있지만 사용중인 E3 ligase와 ligand 수는 제한적이며 현재 20개의 E3 ligase를 타겟하는 100여개의 리간드가 보고되었다. 현재 가장 많이 사용되고 있는 E3 ligase는 CRBN과 VHL이다. 그 외에는 cIAP(cellular inhibitor of apoptosis protein), MDM2(mouse double minute 2), DCAF11(DDB1 and CUL4 associated factor 11), DCAF15, DCAF16, FEM1B(protein fem-1 homolog B), KEAP1 등이 프로탁 개발에 활용될 수 있다고 보고 되어었다.

프로탁의 링커 역시 프로탁 개발에 중요한 부분을 차지 하고 있다. 링커의 길이가 너무 길면 표적 단백질과 E3 ligase가 서로 접근하기 어려워지고 분해 유도를 위한 유비키틴화(ubiquitination) 과정이 일어나기 어려워진다. 반대로 링커가 너무 짧으면 입체장애로 의해 ‘표적 단백질-PROTAC-E3 ligase’의 삼중 복합체(ternary complex)를 형성하기 어렵다. 그렇기에 적절한 길이의 링커 사용이 안정적인 삼중 복합체를 형성에 필요하다. 또한, 링커는 길이 뿐만 아니라 약물의 안정성, 약물성 등의 역할에도 기여하는 것으로 알려져 있어 링커 개발 연구가 다수 수행되고 있다.

2-3. 프로탁의 작용 기작 

그림3. 프로탁 작용기작 (참고문헌 5에서 발췌)

세포 내에서 단백질의 분해는 일반적으로 E3 ligase가 단백질을 인식하여 유비퀴틴화가 일어나고 폴리 유비퀴틴화를 거쳐 프로테아좀에 의해 분해된다. 프로탁은 표적 단백질(POI)과 E3 ligase에 결합하여 복합체를 형성하고 인위적으로 POI와 유비퀴틴이 근접한 위치에 있도록 유도한다 (그림 3). 근접한 표적 단백질의 lysine 잔기는 E2/E3 complex와 유비퀴틴의 thioester bond를 공격하여 유비퀴틴이 표적 단백질에 isopeptide bond 형태로 공유결합된다. 이후 같은 기전을 반복하여 표적 단백질에 polyubiquitination이 일어나고 이후 프로테아좀에 의해 표적 단백질이 분해된다. 프로탁은 다시 해리되어 다른 표적 단백질과 결합하여 추가적인 분해를 유도할 수 있다. 이를 catalytic recycling이라고 하며, 다음과 같은 특별한 기전 때문에 적은양의 프로탁이 세포에 들어가더라도 많은 숫자의 단백질의 분해를 유도할 수 있다.

2-4. 프로탁의 표적 선택

현재까지 다양한 표적 단백질이 프로탁을 이용하여 분해가 시도 되었다. 그렇다면 앞으로는 어떤 표적 단백질을 선택하였을때 프로탁의 장점을 극대화 시킬수 있는지 논의하고자 한다.

1) 돌연변이에 의한 저항성 문제를 가진 표적

프로탁은 특별한 기전을 가지고 있어서 결합력(binding affinity)가 조금 떨어지더라도 안정한 ternary complex(표적 단백질-PROTAC-E3 ligase)만 잘 형성하면 분해능에 큰 문제가 없다 (그림 4). 이는 기존의 저분자 저해제가 표적 단백질의 돌연변이체에 의해 급격하게 결합력을 잃고 효과가 반감되는 것에 비해 높은 저항성을 지녔다고 볼 수 있다. 따라서 이러한 표적을 기반으로 프로탁 개발을 한 경우 기존의 저해제의 단점을 극복할 수 있다.

그림4. 프로탁 분자의 ternary complex 형성 기전 (참고문헌 2에서 발췌)

이에 해당하는 가장 좋은 예시는 C4 Therapeutics의 CFT1946 프로탁이다.  CFT1946은 BRAF V600X 돌연변이체를 특이적으로 표적 하는 프로탁 분자로 현재 임상 1상을 진행 중이며, melanoma, colorectal cancer를 주 표적 암으로 설정하고 있다. 그 외에도 non-small lung cancer, pancreatic cancer 그리고 small intestine cancer 등에도 효능평가를 진행 중이다. CFT1946은 BRAF WT은 분해하지 않으며, 선택적으로 BRAF V600E 돌연변이체를 분해한다 (그림 5).

그림5. CFT1946 의 BRAF V600E 분해능 확인 (참고문헌 9에서 발췌)

2) 비효소적 활성을 가진 표적

현재까지는 저해제를 이용하여 효소적 활성을 저해하여 생물학적 기능을 제어하려고 했다. 그러나 단백질의 효소적인 활성이 아닌 비효소적인 활성이 생물학적 기능에 중요한 경우 기존의 저해제를 사용하여도 효과가 미비한 경우가 관찰되었다. 이런 경우, 프로탁을 개발하게 되면 효과적으로 생물학적 기능을 제어할 수 있다. 예를 들면, EZH2를 TNBC(triple negative breast cancer) 세포주인 MDA-MB-468에서 knockdown을 하면 세포가 죽는다. 그러나 EZH2 저해제인 GSK126, CPI-1205, EPZ6438, C24를 처리하면 암세포를 효율적으로 죽이지 못한다. 이러한 경우 표적 단백질 분해전략 (MS1943)을 사용하게 되면 EZH2 knockdown 효과를 모방할 수 있다 (그림 6)

그림6. TNBC에서 EZH2 저해제와 분해제의 효능 및 EZH2 knockdown 효과 (참고문헌 4에서 발췌)

3) Undruggable 표적으로 여기어졌던 표적

서론에서 설명하였듯이 Undruggable 표적이라고 불리는 단백질은 저분자 화합물로 표적하기 어려운 단백질을 말한다. 그러나 프로탁은 event-driven pharmacology라는 특별한 기전을 가지고 있어서 물질 자체의 결합력이 다소 좋지 않더라도 ternary complex를 잘 형성하는 경우가 있고, 그렇게 되면 표적 단백질을 분해할 수 있게 된다. 따라서 그동안 저분자 화합물로 표적하기 어렵다고 생각했던 STAT3, Tau 단백질 같은 undruggable 표적 단백질들을 표적으로 하는 프로탁이 개발되어 발표되었다. 특히, Tau 단백질은 Tau 단백질들끼리 aggregation 되는 것이 병리학적으로 문제가 되기 때문에 aggregation 되는 것을 막으려는 시도가 많이 있었다. 그러나 저분자 화합물을 이용하여 aggregation을 막으려는 시도는 매우 어려운 시도였고 지금까지도 그렇다 할 저분자 화합물은 발굴되지 않았다. 그러나 프로탁을 활용하였을 때 표적 단백질을 분해할 수 있으므로 tau aggregation 양을 줄일 수 있을 것이란 기대가 있다(그림 7).

그림7. Tau를 표적으로하는 프로탁인 C004019의 화학 구조 및 hTau 마우스 모델의 hippocampus, cortex (soluble), cortex (insoluble) 에서 C004019의 분해능 (참고문헌 3에서 발췌)

4) 선택성을 획득하기 어려웠던 표적

 프로탁은 위에서 설명하였듯이 ternary complex 형성이 가장 중요한데, ternary complex를 형성하는 과정 중에 단백질-단백질 상호작용이 종종 일어난다 (그림 4). 이는 표적 단백질에 대한 선택성 획득의 결과로 나타나게 되고 결과적으로 그동안 저분자 화합물이 보여주었던 선택성보다 더 높은 선택성을 보여주게 된다. 예시로 재미있는 연구가 수행되어 있는데, 기존에 100개의 kinase에 동시에 결합하는 저분자 저해제가 있었다. 이를 이용하여 프로탁을 만들었더니 10개의 kinase만이 분해되는 현상을 보여주었다 (그림 8 좌). 이는 프로탁의 선택성 획득에 대해 가장 잘 보여주는 논문으로 그 동안 저분자 화합물로 구별해기 어려웠던 표적 단백질들에 대해서 프로탁 전략을 이용하면 선택성 부여할 수 있다는 예시를 보여준다. 또 다른  좋은 예시로 C4 테라퓨틱스와 포그혼 테라퓨틱스가 표적으로 하는 BRD9의 브로모 도메인 역시 다른 BRD family와 유사한 브로모 도메인을 가지고 있어서 이를 저분자 저해제로 구별해내는 것은 매우 어려운 일이었다. 그러나 프로탁을 개발하였더니 선택적으로 BRD family 중에 BRD9을 구별하여 분해하는 결과를 보여주었고 (그림 8 우), 이는 궁극적으로 독성 문제에서 좀 더 자유로워질 수 있다는 것을 의미한다. 

그림8. Promiscuous kinase inhibitor를 기반으로 만들어진 프로탁이 선택성 획득 모식도 (좌) 및 BRD9에만 선택적으로 분해하는 포그혼의 FHD-609의 Western Blot과 복합체 형성 TR-FRET 실험 결과 (우) (참고문헌 6, 8 에서 발췌)

3. 결론

글로벌 TPD 전체 시장은 2021년 기준 1400억원 정도로 추산되며 2029년도 3000억원 규모로 점점 더 커질 것으로 추정된다. 국내 및 국외 기업에서는 앞다투어 TPD 파이프라인을 한개 이상씩 확보하고 있다. 이는 표적 단백질을 분해 기술의 잠재력에 대한 기대가 크다는 것을 보여주는 증거라 생각한다. 현재까지 프로탁 연구개발은 항암 표적 단백질에 국한되어 있었으나 앞으로는 항암 이외에 퇴행성 뇌질환이나 면역, 항염증 등 다양한 질환으로 연구 개발이 확장될 것으로 예상된다. 또한, 신규 E3 ligase를 이용하는 프로탁을 개발하여 특정질환 특이적인 프로탁을 개발하려는 연구 역시 더욱 확장될 것으로 예상된다.

그뿐만아니라 지속적으로 신규 TPD 기술이 생겨나고 있으며, 신규 기술들이 기존의 TPD 기술이 표적하지 못하던 표적을 분해하려고 하고있다. 몇가지 신규 기술을 소개하면, transcription factor를 표적으로 하는 TF-PROTAC이나 RNA를 표적 분해하는 RiboTAC, 표적 단백질의 binding partner 단백질을 표적으로 하는 Bridged PROTAC 등의 신규 TPD 기술들이 이에 해당한다. 앞으로 이런 신규 기술을 잘 접목시킨다면 그 동안 표적하기 어렸웠던 질환들에 대해서도 새로운 치료제 개발 방향성을 제시할 수 있을거라 생각한다.

4. 참고문헌

1. Békés, M., Langley, D. R., & Crews, C. M. (2022). PROTAC targeted protein degraders: the past is prologue. Nature reviews. Drug discovery, 21(3), 181–200.

2. Gadd, M. S., Testa, A., Lucas, X., Chan, K. H., Chen, W., Lamont, D. J., Zengerle, M., & Ciulli, A. (2017). Structural basis of PROTAC cooperative recognition for selective protein degradation. Nature chemical biology, 13(5), 514–521.

3. Wang, W., Zhou, Q., Jiang, T., Li, S., Ye, J., Zheng, J., Wang, X., Liu, Y., Deng, M., Ke, D., Wang, Q., Wang, Y., & Wang, J. Z. (2021). A novel small-molecule PROTAC selectively promotes tau clearance to improve cognitive functions in Alzheimer-like models. Theranostics, 11(11), 5279–5295.

4. Ma, A., Stratikopoulos, E., Park, K. S., Wei, J., Martin, T. C., Yang, X., Schwarz, M., Leshchenko, V., Rialdi, A., Dale, B., Lagana, A., Guccione, E., Parekh, S., Parsons, R., & Jin, J. (2020). Discovery of a first-in-class EZH2 selective degrader. Nature chemical biology, 16(2), 214–222.

5. Dale, B., Cheng, M., Park, K. S., Kaniskan, H. Ü., Xiong, Y., & Jin, J. (2021). Advancing targeted protein degradation for cancer therapy. Nature reviews. Cancer, 21(10), 638–654.

6. Bondeson, D. P., Smith, B. E., Burslem, G. M., Buhimschi, A. D., Hines, J., Jaime-Figueroa, S., Wang, J., Hamman, B. D., Ishchenko, A., & Crews, C. M. (2018). Lessons in PROTAC Design from Selective Degradation with a Promiscuous Warhead. Cell chemical biology, 25(1), 78–87.e5.

7. Hughes, S. J., & Ciulli, A. (2017). Molecular recognition of ternary complexes: a new dimension in the structure-guided design of chemical degraders. Essays in biochemistry, 61(5), 505–516.

8. https://foghorntx.com/

9. https://ir.c4therapeutics.com/