생화학분자생물학회

TALE 기반 미토콘드리아 A to G 유전자 편집기의 개량을 통한 표적 특이성 향상 매개

Engineering TALE-linked deaminases to facilitate precision adenine base editing in mitochondrial DNA

Cell  187, 95–109. 2024

홍성호 : 서울대학교 수의과대학 수의학과 (gh0121@snu.ac.kr)

이현지 : 고려대학교 의과대학 의과학과 (hjlee102@korea.ac.kr)

​연구배경

미토콘드리아는 세포 내 에너지 공장으로서 그 역할이 중요함에 따라, 기능에 이상이 생길 경우 세포와 나아가 개체에 치명적인 결과를 초래하게 된다. 

미토콘드리아는 자체적으로 13개의 단백질과 2개의 rRNA, 22개의 tRNA를 전사하는 유전자를 보유하고 있는데(1) 이 유전자에 돌연변이가 생기고, 그것이 축적되었을 때 발생하는 병증을 미토콘드리아성 유전질환으로 명명하며, 대게 치명적인 증상으로 이어진다.

CRISPR-Cas9 과 그것을 기반으로 하는 다양한 유전자편집기의 등장 이후, 유전질환 매개 돌연변이를 세포 혹은 동물 모델에 도입함으로써 유전질환에 대한 다양한 비임상실험이 가능해졌으나, 미토콘드리아성 유전질환의 경우에는 미토콘드리아로의 Guide RNA 수송 문제로 인해 기존 편집기를 이용한 유전질환 돌연변이 도입이 이뤄질 수 없다는 한계점이 존재한다(2).

CRISPR-Cas9 이전에 유전자 편집에 사용되던 TALEN의 경우, 전부 단백질로 이루어진 구조이기 때문에 미토콘드리아 수송에 문제가 없다는 점에서 착안하여 TALE 반복 도메인에 C to T Deaminase를 연결한 미토콘드리아 유전자 편집기 DdCBE가 개발되었고(3), 나아가 A to G 유전자 편집기 TALED 또한 개발되었으나(4), DdCBE와는 달리 TALED의 경우 동물 모델 개발과 같은 추가적인 활용에 대한 연구가 이루어지지 않았다.

본 연구에서는 미토콘드리아 A to G 유전자편집기인 TALED에서, TadA8e Deaminase가 전체 Transcriptome에서 무작위적 RNA 편집을 일으키고, 그로 인해 마우스 배아 미세주입시 발달 정지와 같은 부작용이 나타난다는 것을 규명하였다. 나아가 개량된 TadA8e Variant를 도입하여 앞선 부작용이 개선된 유전자 편집기를 개발하였고, 이를 활용하여 최초의 미토콘드리아 A to G 유전자 편집 마우스를 제작함으로써 미토콘드리아성 유전질환 연구를 위한 초석을 마련하였다 (그림1).

그림1. 미토콘드리아 A to G 유전자 편집기 개량 및 적용 

연구결과 

1. 기존 유전자 편집기의 무작위적 RNA 편집 활성 규명

미토콘드리아 A to G 유전자편집기인 TALED(sTALED : split TALED)의 구성 요소로는 미토콘드리아로의 수송에 사용되는 MTS (Mitochondrial Targeting Signal), DNA 서열 인식에 사용되는 TALE repeats, DNA 이중가닥 완화를 위한 DddAtox, 그리고 풀린 단일가닥 DNA의 염기서열 편집을 가능하게 하는 TadA8e deaminase를 사용하며 이는 기존의 Cas9 기반 A to G 유전자 편집기로써 가장 널리 사용되는 ABE8e에서 차용된 것이다(5). C to T 유전자편집기 DdCBE의 경우에는 DddAtox가 C to U deamination을 수행하며, UGI를 통해 Uracil glycosylation을 방해하여 복제시 C to T 변형이 일어나게끔 한다 (그림2A).

미토콘드리아의 Cox3.1 유전자로 유도되는 TALE repeats 보유 sTALED를 HEK293T cell에 처리한 후, Transcriptome-wide sequencing을 실시했을 때, Untreated 대비 무작위적 RNA 편집이 전체 Transcriptome에서 다발적으로 발생함을 확인 하였다 (그림2B).

TALED 사용 시 50000곳 이상에서 7% 이상의 편집이 발생하고 그 중 99.8% 이상이 A to G edit임에 비해, TadA8e가 없는 DdCBE나 TALED의 왼쪽 split만 사용 한 경우 (Left-1397N only) Untreated와 비슷한 수준의 무작위적 RNA 편집이 일어남을 관찰하였다 (그림2C).

기존에 개발된 TadA8e variant 중 무작위적 RNA 편집이 줄어드는 것으로 알려진 V106W, V106G, F148A, K20/R21A (6-8)등의 variant를 도입한 경우에도 기존 sTALED(TadA8e)에 비해 줄어들기는 하나 여전히 Untreated에 비해 높은 수준의 무작위적 RNA editing이 일어남을 확인하였고, 다른 유전자로 유도되는 sTALED와 Variant들을 제작하여 실험했을 때에도 같은 결과를 확인하였다 (그림2D,E)

그림2. 미토콘드리아 유전자 편집기 적용 후 Transcriptome-wide sequencing 분석 

2. 표적 특이적 TadA8e Variant 개발

sTALED에서 TadA8e에 의해 무작위적 RNA 편집이 발생하는 것을 확인함에 따라, 이러한 무작위적 활성을 낮추는 변이를 개발하기 위해, TadA8e의 활성화부위로 알려진 아미노산 후보 11개가 각각 다른 아미노산 19개로 치환된 TadA8e variants 보유 sTALED를 제작하여 활성의 변화를 알아보았다. 총 209개의 Variant(11X19)을 HEK293T cell에 처리한 후, 불활성화 되는 Variant를 제외하기 위해 유도된 유전자의 (Cox3.1) 편집 효율을 확인한 결과 101개의 Variant가 기존 sTALED 대비 50% 이상의 효율을 보였고, 이전 Transcriptome-wide sequencing에서 높은 수준으로 변이가 일어났던 6곳의 RNA amplicon sequencing을 실시하여 무작위적 RNA 편집 활성을 알아보았을 때, 12개의 Variant가 무작위적 RNA 편집은 줄어들고 유도된 유전자 편집 효율은 유지하는 것을 확인하였다 (그림3A, 화살표로 표시). 

이 12개의 Variant가 처리된 HEK293T cell의 Transcriptome-wide sequencing을 실시했을 때, 기존 sTALED나 이전에 연구된 V106W variant에 비해 모두 무작위적 RNA 편집이 크게 감소함을 확인하였고(그림3B,C) 그 중 무작위적 RNA 편집이 제일 많이 감소한 4개 variant를 다른 유전자로 유도하여 실험했을 때에도 마찬가지의 결과를 확인하였다. (그림3D,E)

그림3. TadA8e Variant TALED의 효율 확인 및 Transcriptome-wide sequencing 

3. 개량된 Variant의 표적 내 Bystander 편집 감소 확인

현재 유전자 염기 편집기의 한계점 중 하나로 대두되는 것은 유도된 Target window내에서 원하는 염기 외의 서열이 변하는 Bystander 편집이 일어나는 것이라고 할 수 있는데, 무작위적 RNA 편집이 가장 크게 감소한 2개 Variant (V28R, R111S)의 경우 이러한 Bystander 편집 활성 또한 감소시킬 수 있다는 가정 하에 Target에서의 편집 양상을 관찰하였다.

Target에 따른 차이가 있으나, 3개 Target (Cox3.1, ND1, ND6)에서 V28R, R111S variant가 모두 Bystander 편집이 기존 sTALED와 V106W variant에 비해 감소하는 양상을 관찰할 수 있었고 (그림4A), 그 중 ND1 target에서의 편집된 allele을 분석 해 보았을 때 기존 sTALED와 V106W variant의 경우 편집된 Major allele이 Bystander 편집이 함께 일어난 것임에 비해 (그림4B, 검은색 막대), V28R, R111S variant의 경우 편집된 Major allele이 단일 염기 편집이 일어난 것임을 확인 할 수 있었으며 (그림4B, 빨간색 막대), 특히 V28R variant의 경우 단일 염기 편집이 일어난 Major allele이 R111S variant보다도 더 높은 수준으로 일어남을 확인하여 무작위적 RNA 편집이 감소할 뿐만 아니라, Target window내의 Bystander 편집까지 높은 수준으로 감소시킨 것을 확인하였다.

그림4. Deep-sequencing을 통한 TadA8e Variant TALED의 Target 내 편집 양상 확인 

4. 미토콘드리아 A to G 유전자 편집 마우스 제작

TadA8e를 보유한 기존의 sTALED와 mTALED(monomeric TALED)를 이용하여 (그림5A) 미토콘드리아 A to G edited 마우스를 제작하고자 하였을 때에는 In-vitro transcription 된 mRNA를 배아에 미세주입 하고 배반포기까지 성장시킨 후 (4day) 편집효율을 분석하였을 때, Target 유전자나 mTALED, sTALED에 차이에 관계없이 정상적으로 성장한 Blastocyst의 경우 Rnr1 target-mTALED에서는 30개중 1개, ATP6 target-sTALED에서는 19개중 1개로 매우 낮은 확률을 제외하면 편집효율이 나타나지 않았고, 발달이 정지된 2세포기-4세포기의 배아에서만 편집효율이 나타남을 확인했다 (그림5B,C).

이러한 발달 정지가 기존 TadA8e의 무작위적 RNA 편집 활성에 의한 것임을 감안하여 V28R variant ATP6 target-sTALED을 제작한 후 미세주입 하였을 때에는 배아 발달 정지가 전혀 일어나지 않았으며, 88개 중 28개가 6~54%(평균 39%)의 편집효율을 갖는 것을 통해, V28R variant TALED를 활용할 경우 무작위적 RNA 편집, Bystander 편집이 감소하는 것과 더불어 미세주입 후 배아 발달 또한 정상적으로 일어남을 확인했다 (그림5D).

그림5. 기존 TALED와 V28R TALED의 마우스 배아 미세주입 후 효율 분석 

5. 미토콘드리아 유전질환 모사 마우스 표현형 분석

앞선 결과를 바탕으로 미토콘드리아 A to G 돌연변이 관련 유전 질환 모사 마우스를 제작하기 위해, 미토콘드리아 유전질환인 Leigh 증후군의 환자 중 ATP6 유전자에서 발견되는 mt.T9185C(L220P), mt.T9191C(L222P) 돌연변이를 선정하여(9) 마우스의 ATP6 유전자에서 동일한 아미노산 변이를 일으킬 수 있게끔 하는(마우스 기준 mt.T8585C, mt.T8591C) V28R sTALED를 제작하였다.

이를 마우스 배아에 미세주입한 후, 대리모에 이식하여 태어난 산자들을 Genotyping 했을 때 의도한 유전자 돌연변이를 보유하고 있는 마우스가 제작되었음을 확인하였다.(그림6A)

이전에는 미토콘드리아 유전자 돌연변이를 일으킬 수 없었기 때문에 미토콘드리아 전자전달계 Complex 구성 단백질 중 핵 유래 단백질의 Knock-out 마우스를 제작하는 방식으로 Leigh 증후군을 모사한 연구에서 서맥성 부정맥 관련 표현형을 관찰한 바 있기 때문에(10) ATP6 mutant 마우스에서도 동일한 표현형이 나타나는지 관찰해보았다. 그 결과 유전자 편집이 일어나지 않은 Littermate 마우스에 비해 ATP6 mutant 마우스의 경우 유의한 수준의 심박수 감소가 발생한 것을 확인하였고 (그림6B) 나아가 ATP6 마우스의 Embryonic Fibroblast cell (MEF)을 제작하여 미토콘드리아 산소소비능 측정 (OCR)을 실시했을 때 Wildtype 마우스 유래 MEF를 크게 밑도는 결과를 관찰함으로써 V28R sTALED로 유도한 ATP6 돌연변이가 마우스에서 미토콘드리아성 병증 표현형을 나타냄을 검증하였다 (그림6C).

그림6. ATP6 mutant 마우스 Genotype 결과 및 병증 표현형 확인 

연구성과 및 의의

본 연구에서는 기존에 A to G Deaminase로서 잘 알려져 있고 ABE를 통해 널리 사용되는 TadA8e deaminase가, 전체 Transcriptome에 대한 무작위적 RNA 편집을 일으키며 그로 인하여 마우스 배아 발달 정지와 같은 부작용을 일으킬 수 있다는 점을 규명하였다. 나아가 앞선 부작용을 개선하기 위해 무작위적 활성은 낮고, 타겟 편집 효율은 유지되는 Variant를 개발하였고, 기존 TALED와 V28R variant TALED를 비교하였을 때 무작위적 활성이 높은 수준으로 개선되었음을 확인하였다. 또한, V28R variant TALED를 이용하여 미토콘드리아 A to G 유전자 편집이 일어난 마우스를 제작하였으며 해당 마우스가 의도된 대로 Leigh 증후군 돌연변이에 대한 병증 표현형을 나타내는 것을 확인하였다.

미토콘드리아성 유전질환은 5000명 중 1명 꼴로 발생하며 그 증상이 치명적인 것에 비해, 연구가 많이 이루어져 있지 않고 병증에 대하여 직접적인 치료 효과를 갖는 치료제 또한 아직 개발된 바 없지만, 본 연구에서 개발한 무작위적 활성이 낮은 미토콘드리아 A to G 유전자 편집기는 환자의 미토콘드리아 유전자 돌연변이 정상화를 매개하는 영구적 치료제로 개발하여 사용될 수 있으며 세계 최초로 제작한 미토콘드리아 A to G 돌연변이 관련 유전 질환 모사 마우스는 미토콘드리아 유전질환 치료제 개발을 위한 비임상 플랫폼으로서 사용될 수 있다. 따라서 본 연구가 미토콘드리아성 유전질환 연구와 치료의 관점에서 다음 단계로 넘어가는 초석으로 작용하기를 기대하는 바이다.

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