생화학분자생물학회

비브리오 패혈증균의 MARTX 독소 발현에 의한 

적혈구 PS 노출을 매개한 혈전생성 원인 규명 

MARTX toxin of Vibrio vulnificus induces RBC phosphatidylserine exposure 

that can contribute to thrombosis

Nature Communications | (2022) 13: 4846

정한영 

서울대학교 식품바이오융합연구소 연구조교수 

(E-mail: robin302@snu.ac.kr)

연구배경

비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus)은 기저질환이 있거나 면역력이 저하된 고위험군 환자의 경우 치사율이 약 50%에 달하는 치명적인 병원균으로서 주로 오염된 어패류를 섭취하거나 오염된 해수에 상처 부위가 노출되었을 때 감염된다. 특히, 해수의 온도가 상승하는 여름철에 빈발하며 국내에서도 매년 약 50 여 건의 감염사례가 지속적으로 발생하고 있어, 비브리오 패혈증균의 병원성을 이해하고 효과적인 치료 방법을 개발하기 위한 연구가 필수적이다.

비브리오 패혈증균에 감염된 환자는 소화관 장애, 용혈성 빈혈 (Hemolytic anemia), 패혈증의 증상을 보이지만, 많은 임상문헌에서 치명적인 정맥혈전증 (Deep vein thrombosis)을 수반된다고 보고되고 있는 반면에 그의 정확한 기전은 알려진 바 없다. 본 연구에서는 병원성미생물이 적혈구의 형태 및 분자생물학적 변화를 매개하여 혈전생성을 유도한다는 새로운 패러다임을 제시하고 발굴된 유해인자 제어를 통한 치료방안을 제안하였다. 

연구결과

1. 비브리오 패혈증균에 의한 적혈구 형태학적 변화 및 세포기능 변화

비브리오 패혈증균 (Vibrio vulnificus)에 감염된 사람에게 용혈성 빈혈이 흔히 관찰되며, 최근 적혈구도 혈전 (Thrombosis) 생성에 적극적으로 가담한다는 연구 보고로부터 인체 적혈구를 타겟으로 본 연구의 가설을 세웠다. 먼저, 자원봉사자로부터 분리한 적혈구를 비브리오 패혈증균에 감염시키면 적혈구 정상상태 discocyte 형태에서 별모양의 echinocyte를 거쳐 작은 구형의 spherocyte로 단계적으로 형태변화를 일으킴을 SEM, confocal microscopy로 최초로 확인하였다 (그림 1). 감염 시 적혈구의 분자생물학적 변화를 FACS로 확인한 결과 세포막 표면에 Phosphatidylserine (PS) 노출과 수많은 Microvesicle (MV)이 생성됨을 확인하였고 그 기전은 세포 내 Calcium 증가, Caspase-3 활성증가, 세포막 효소 (Scramblase)가 유기적으로 관여함을 밝혔다 (그림 2). PS 노출과 MV 생성은 적혈구의 응집촉진 활성 (Pro-coagulant activity)을 일으킨다. 즉, 혈액응고인자 Thrombin 생성, 적혈구의 혈관내피세포 부착, 적혈구-적혈구 응집 등의 세포기능 변화를 유발하여 혈전촉진 활성 (Pro-thrombotic activity)을 수반함을 in vitro 실험에서 규명하였다 (그림 3). 

그림 1. 비브리오 패혈증균에 의한 적혈구 형태변화

그림 2. 비브리오 패혈증균에 의한 적혈구 혈전 생성 기전

그림 3. 비브리오 패혈증균에 의한 적혈구 세포기능 변화

2. 비브리오 패혈증균의 원인 virulence factor 확인

비브리오 패혈증의 유해인자를 확인하기 위하여 적혈구에 균을 감염시키고 genomic-, transcriptomic analysis를 통하여 MARTX toxin 관련 유전자인 rtxA gene이 현저히 발현됨을 확인하고 rtxA mutant 균주를 사용하여 실제로 MARTX toxin이 in vitro 적혈구 변화에 주요 유해인자임을 확인하였으며 intracellular calcium이 주요한 역할임을 밝혔다 (그림 4). MARTX toxin은 effector domain과 pore-forming region으로 구성되어 있는데 각각의 중요성을 파악하기 위하여 몇 가지 mutant를 구축하여 사용한 결과 pore-forming region이 주요한 역할임을 확인하였다 (그림 5). 이 결과는 적혈구 세포 내 calcium 변화와 morphological change와 일치하였다.

그림 4. 비브리오 패혈증균의 MARTX toxin에 의한 적혈구의 혈전생성능 확인

그림 5. 비브리오 패혈증균의 MARTX toxin 중 pore-forming region에 의한 혈전생성능 확인

3. In vivo 정맥혈전 동물모델에서 확인 

마지막으로 흰쥐(Rat)에 비브리오 패혈증균을 주사하니 in vitro에서 관찰된 것과 같은 적혈구의 echinocyte 형태변화가 일어났다. 또한 정맥혈전 동물모델에 비브리오 패혈증균(WT)을 감염시키면 용량의존적으로 혈전생성이 증가하였지만 mutant 균주들을 주사하면 대조군 수준으로 혈전이 생성이 감소되었다(그림 6). 이상의 결과는 in vitro 실험결과와 매우 유사함을 확인하였다.

그림 6. 비브리오 패혈증균 감염에 의한 in vivo에서 적혈구 형태변화(a) 및 정맥혈전 동물모델(b)에서 wild type과 mutants에 따른 혈전생성량 변화 (c, d).  

결론

본 연구로부터 비브리오 패혈증균에 감염되면 혈액에서 MARTX toxin 관련 유전자인 rtxA gene이 발현되어 적혈구 세포막에 끼어들어 pore를 형성하여 intracellular calcium 증가를 유발한다. 증가된 calcium은 적혈구 형태변화를 일으켜 궁극적으로는 hemolysis를 일으키며 동시에 적혈구 표면에 PS 노출, MV 생성을 유발하여 pro-coagulant activity, pro-thrombotic activity와 같은 적혈구 기능상의 변화를 유발한다. 이 과정에서 rtxA의 pore-forming region이 중요한 역할을 수행함을 확인하였으며 in vivo 정맥혈전 동물모델을 사용하여 in vitro 결과와 일치함을 밝혔다 (그림 7). 본 연구를 통하여 비브리오 패혈증 감염환자에서 발생하는 정맥혈전 생성의 원인을 최초로 규명하였으며 유해인자를 확인함으로써 환자 치료에 적용될 가능성을 제시하였다.

그림 7. 비브리오 패혈증균 감염에 의한 적혈구를 매개한 혈전생성 기전

참고문헌

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2. Matsuoka, Y. et al. (2013) Accurate diagnosis and treatment of Vibrio vulnificus infection: a retrospective study of 12 cases. Braz. J. Infect. Dis. 17, 7–12.

3. Chung, S. M. et al. (2007) Lysophosphatidic acid induces thrombogenic activity through phosphatidylserine exposure and procoagulant microvesicle generation in human erythrocytes. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27, 414–421.

4. Cho, C., Choi, S., Kim,M. H. & Kim, B. S. (2022) Vibrio vulnificus PlpA facilitates necrotic host cell death induced by the pore forming MARTX toxin. J. Microbiol. 60, 224–233.

5. Kim, B. S., Gavin, H. E. & Satchell, K. J. F. (2015) Distinct roles of the repeat containing regions and effector domains of the Vibrio vulnificus multifunctional-autoprocessing repeats-in-toxin (MARTX) toxin. MBio 6, e00324-15.

6. Weisel, J. W. & Litvinov, R. I. (2019) Red blood cells: the forgotten player in hemostasis and thrombosis. J. Thromb. Haemost. 17, 271–282.

7. Whelihan, M. F., Zachary, V., Orfeo, T. & Mann, K. G. (2013) Prothrombin activation in blood coagulation: the erythrocyte contribution to thrombin generation. Blood 122, 1532.