생화학분자생물학회

TAUCON과 TAUCOM: 타우의 과인산화와 관련된 세포 내 병리학적 변화를 탐지하는 형광공명에너지전이 기반의 새로운 바이오센서

TAUCON and TAUCOM: A novel biosensor based on fluorescence resonance energy transfer for detecting tau hyperphosphorylation-associated cellular pathologies

Biosensors & Bioelectronics 237, 115533 (2023)

안상현: 부산대학교 자연과학대학 생명시스템학과 박사과정 (shahn0707@pusan.ac.kr)​

김태진: 부산대학교 생명과학과/생명시스템학과(대학원) 교수 (tjkim77@pusan.ac.kr)​

연구배경

신경 퇴행성 질환은 말초 혹은 중추 신경계의 구조와 기능이 급격히 손실되는 질환으로 발병률이 높아짐에 따라 인류 건강에 큰 위협이 되고 있다(1). 대표적인 예로 알츠하이머, 파킨슨, 헌팅턴 등이 있으며 이와 같은 질환은 기억력 및 인지 장애를 유발한다. 신경 퇴행성 질환에 대한 광범위한 연구가 진행되어 왔지만 정확한 원인과 메커니즘은 규명되지 않았다. 최근 타우 병증 가설이 신경 퇴행성 질환의 발병과 진행의 주요 요인으로 주목받고 있다(2). 신경세포의 비정상적인 타우 단백질이 신경세포 사멸을 유도한다는 것이다. 이는 변형되거나 응집된 타우 단백질이 많은 신경 퇴행성 환자에게서 발견되면서 연구가 집중적으로 이루어졌다. 타우는 용해성과 유연성이 매우 높고 인산화를 통해 미세소관과 세포질 사이를 역동적으로 이동하여 미세소관 역학 조절과 세포 골격 안정성 유지에 관여하는 단백질이다(3,4). 그러나 타우 병증에서는 타우의 용해도가 감소하여 비정상적인 과인산화가 발생하고 구조변화와 잘림, 그리고 응집이 유도되어 올리고머를 형성한다(그림 1)(5). 계속되는 응집현상으로 타우는 미세소관에 대한 친화력을 잃고 세포질에서 신경섬유 엉킴이라는 구조를 형성하게 된다. 결론적으로 타우가 없는 미세소관은 붕괴되고 신경세포 시냅스가 사라지면서 신경세포의 형태변화와 사멸까지 이어진다(6). 타우의 병리학적 중요성에도 불구하고 이러한 병리과정을 촉발하는데 필요한 메커니즘 및 원인에 대한 파악이 부족하다. 이는 생리학적 및 병리학적 조건에서 타우의 분자 역학을 모니터링할 수 있는 적절한 방법이 없기 때문이며, 특히 병증 초기에 정상 타우가 과인산화 상태로 전환되는 과정을 정밀하게 검사할 방법론이 존재하지 않기 때문이다.

따라서 본 연구에서는 두 가지 FRET-기반 바이오센서, TAUCON과 TAUCOM을 개발했다. 해당 센서는 병증 초기 단계의 형태변화를 고해상도 및 시공간적으로 모니터링 함으로써 돌파구를 제시한다.

그림 1. 타우 단백질의 생리학적 및 병리학적 상태 변화

연구결과

1. 구조변화를 탐지하는 타우 바이오센서: 타우병증 연구를 위한 새로운 도구

과인산화 및 미세소관 분리로 인한 타우 구조변화를 확인하기 위해 청색 형광단백질(ECFP)과 황색 형광단백질(YPet)을 결합한 형광공명에너지전이(FRET) 시스템을 사용했다(그림 2). 타우가 과인산화되면 아미노산 5-15 잔기와 312-322 잔기가 서로 상호작용하여 구조적 변화를 유발한다(7). 각 잔기의 옆에 ECFP와 YPet을 부착함으로써 과인산화에 의한 타우 구조변화를 탐지하는 TAUCON을 개발했고 R3, R4 도메인을 제거함으로써 미세소관과의 결합력을 감소시켜 세포질에만 존재하도록 한 용해성 TAUCON-SF도 제작했다. 그리고 5-15 또는 312-322 잔기를 제거하여 TAUCON에 대한 음성대조군 바이오센서도 개발하였다. 기존 상태에서 TAUCON은 433nm의 빛에 의해 여기된 ECFP가 478nm의 형광신호를 생성하지만 과인산화되어 형태가 변한 TAUCON은 ECFP와 근접한 YPet으로부터 527nm의 형광신호를 생성한다(그림 2B). 반면, 미세소관에 결합된 타우 단백질은 N-말단과 C-말단이 근접하는 paper-clip 구조를 형성한다(8). 각 말단에 ECFP와 YPet을 부착하여 기존 상태에서 YPet으로부터 527nm의 형광신호를 생성하지만 미세소관 분리 시 생기는 구조 변화로 두 형광단백질이 멀어져 478nm의 형광이 방출된다(그림 2C). 따라서 바이오센서 발현 수준과 무관한 FRET/ECFP 형광 신호 방출 비율을 계산하여 각 센서의 구조적 변화를 시각화 및 정량화 할 수 있다.

그림 2. FRET-기반 타우 형태 변화 바이오센서의 설계

2. TAUCON 바이오센서의 특성화 및 검증

제작된 두 가지 TAUCON의 감지능을 평가하기 위해 센서를 형질 도입시킨 세포에서 타우의 과인산화를 유도했다(그림 3). 타우는 미세소관에 결합된 형태 혹은 세포질에서 높은 용해성과 유연성을 가진 상태로 존재한다. 먼저 과인산화에 의한 형태 변화를 용해성 타우에서만 확인하고자 TAUCON-SF를 세포에 형질 도입시켜 실시간 고해상도 이미징을 수행하였다(그림 3A). 각 세포는 타우 과인산화를 유도하는 것으로 알려져 있는 forskolin을 처리하였고 160분 동안 FRET/ECFP 형광 방출 비율이 점차적으로 증가했다(그림 3B). 추가적으로 내인성 타우의 생리 및 병리학적 역학을 최대한 유사하게 탐지하기 위해 미세소관 결합 상태와 용해성 상태가 공존하는 타우-미세소관 역학을 지닌 TAUCON의 실시간 이미징을 수행하였다(그림 3C). Forskolin을 처리한 세포 이미지를 미세소관 영역과 용해성 타우 영역으로 나누어 분석하였다. 용해성 타우 영역에서는 20분부터 FRET/ECFP 형광 방출 비율이 유의하게 증가하였으나 미세소관 영역에서는 비율 변화가 없었다(그림 3D). 이는 타우의 초기 병리학적 변화가 용해성 타우에서 먼저 발생한다는 기존 연구와 일치한다.

그림 3. 과인산화 유도에 의한 TAUCON, TAUCON-SF 바이오센서 검증

3. 타우 응집 전 과인산화를 탐지하는 TAUCON 바이오센서

바이오센서를 통한 타우 병증 초기 단계의 특징적인 변화를 감지하는 것은 신경퇴행성 질환 연구의 발전에 크게 기여할 수 있다. 하지만 현재 사용 가능한 타우 바이오센서는 주로 타우 병증의 후기 단계에 해당하는 응집을 감지한다(9). 따라서 개발한 TAUCON 센서가 타우 응집센서인 BiFC-Tau보다 더 빠른 변화를 감지할 수 있는지 확인하기 위해 실시간 세포 이미징을 수행, 두 센서의 형광 변화를 비교했다(그림 4). 160분 동안 BiFC-Tau는 대조군에 비해 형광 강도에 큰 변화가 없었지만, TAUCON의 FRET/ECFP 방출 비율은 유의미하게 변화했다. 이는 세포 기반 연구에서 응집보다 초기 단계에서 과인산화에 의해 유도된 형태 변화가 발생하고 본 바이오센서가 이를 탐지할 수 있음을 의미한다.

그림 4. 응집에 비해 타우병증 초기에 발생하는 과인산화에 의한 타우 구조변화

4. TAUCOM: 미세소관 분리 여부에 따른 구조변화를 탐지하는 바이오센서

TAUCON 실험 결과를 바탕으로 미세소관 결합 타우는 병증 초기에는 과인산화에 의한 형태적 변화가 없지만 진행과정 중에 차츰 분리되어 응집되며 궁극적으로 미세소관 파괴를 유도할 것이라는 가설을 세웠다. 이를 위해 미세소관 관련 타우의 변화를 추적할 수 있는 TAUCOM의 개발이 필요했다. TAUCOM의 검증을 위해 미세소관 붕괴 약물인 nocodazole과 타우 단백질과 경쟁적으로 미세소관과 결합하는 paclitaxel을 처리하여 실시간 이미징을 수행했다(그림 5A). 그 결과 대조군에 비해 TAUCOM의 FRET/ECFP 형광 방출 비율이 점차 감소하는 것을 확인하였다(그림 5B). 반면, TAUCON은 어떠한 변화도 보이지 않았으며(그림 5C,D) 이는 본질적으로 TAUCOM은 미세소관 결합 여부만, TAUCON은 과인산화에 의한 형태 변화만 탐지하는 분리된 기능을 지님을 의미한다.

그림 5. TAUCOM 검증 및 특성화

연구성과 및 의의

타우는 높은 용해성과 유연성을 지닌 단백질이고 미세소관과 역동적으로 상호작용하며 형태가 쉽게 변하기 때문에 타우 병증 초기에 발생하는 특징을 식별하는 것이 중요하다. 타우 병증의 특징으로 타우 단백질의 과인산화/구조변화/절단/응집으로 이어지는 비정상적인 형태변화가 있지만 이러한 병리 과정을 촉발하는 분자 메커니즘이나 원인의 파악은 부족한 실정이다. 또한, 현재 타우 단백질을 탐지하는 진단 마커 관련 연구는 낮은 정확성과 해상력, 병리학적 후기 단계를 탐지한다는 한계를 가지고 있다. 즉, 타우의 초기 분자 역학을 정밀하게 모니터링할 시스템이 시급한 상황이며 본 연구실은 이를 타개하기 위해 바이오센서를 개발하였다.

본 연구진은 세포 수준에서 높은 해상도로 타우 단백질의 병적인 초기 변화를 감지하는 바이오센서를 개발하였다. 타우 단백질에 대한 기존 세포 연구는 비생물학적으로 시험관 내 조건에서 수행되며, 타우 단백질의 과한 뭉침을 화학적 인위적으로 유도하기 때문에 실제 적용에 어려움이 있다. TAUCON, TAUCOM 바이오센서는 살아있는 세포에서의 타우 단백질의 실시간 변화를 고해상도 현미경을 활용하여 미세한 변화도 잡아내는 정밀성을 지님으로써 기존 연구의 한계를 돌파했다.

두 바이오센서가 활용됨에 따라 신경퇴행성 질환의 진행과정을 연구하는 기초과학 연구자들이나 신경퇴행성질환 진단 시스템을 구축하려는 병원, 저해제나 표적 치료제를 개발하는 제약 연구자들에게 실험 방법 및 연구 재료로써 제공 가능해진다. 이를 통해, 초고령화 사회에서 필수적으로 선행되어야 하는 치매의 조기 진단 및 조기 치료제 개발에서 큰 비용 절감을 기대할 수 있다. 게다가, 바이오센서와 대량의 물질을 검출, 선별하는 스크리닝 기술을 융합한 플랫폼을 구축하여 수많은 치매 치료제 후보군들에 대한 독성 영향 평가에도 활용 가능하다. 이는 단시간에 높은 정확도와 정밀도로 동시 다발적으로 여러 약물의 정보를 습득하여 정형화된 약물 안정성 평가 기준을 확립할 수 있을 것으로 기대된다. 궁극적으로 이러한 국내 치매 산업의 발전은 국민 건강보호 효과와 삶의 질 향상을 가져올 것이다.

참고문헌

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1. Taylor, J. P., Hardy, J. and Fischbeck, K. H. (2002) Toxic proteins in neurodegenerative disease. Science. 296, 1991-1995.

2. Kametani, F. and Hasegawa, M. (2018) Reconsideration of amyloid hypothesis and tau hypothesis in Alzheimer's disease. Front. Neurosci. 12.

3. Wright, P. E. and Dyson, H. J. (2015) Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16, 18-29.

4. Lasagna-Reeves, C. A., Castillo-Carranza, D. L., Sengupta, U., Clos, A. L., Jackson, G. R. and Kayed, R. (2011) Tau oligomers impair memory and induce synaptic and mitochondrial dysfunction in wild-type mice. Mol. Neurodegener. 6, 1-14.

5. Min, S. W., Chen, X., Tracy, T. E., Li, Y., Zhou, Y., Wang, C., Shirakawa, K., Minami, S. S., Defensor, E., Mok, S. A., Sohn, P. D., Schilling, B., Cong, X., Ellerby, L., Gibson, B. W., Johnson, J., Krogan, N., Shamloo, M., Gestwicki, J., Masliah, E., Verdin, E. and Gan, L. (2015) Critical role of acetylation in tau-mediated neurodegeneration and cognitive deficits. Nat. Med. 21, 1154-1162.

6. Irwin, D. J. (2016) Tauopathies as clinicopathological entities. Park. Relat. Disord. 176, 139-148.

7. Ibarra-Bracamontes, V. J., Escobar-Herrera, J., Kristofikova, Z., Ripova, D., Floran-Garduno, B. and Garcia-Sierra, F. (2020) Early but not late conformational changes of tau in association with ubiquitination of neurofibrillary pathology in Alzheimer's disease brains. Brain Res. 1744.

8. Alonso, A. D., Cohen, L. S., Corbo, C., Morozova, V., ElIdrissi, A., Phillips, G. and Kleiman, F. E. (2018) Hyperphosphorylation of Tau Associates with changes in its function beyond microtubule stability. Front. Cell. Neurosci. 12, 1-11.

9. Tak, H. J., Haque, M. M., Kim, M. J., Lee, J. H., Baik, J. H., Kim, Y. S., Kim, D. J., Grailhe, R. and Kim, Y. K. (2013) Bimolecular fluorescence complementation; Lighting-up tau-tau interaction in living cells. PLoS One. 8, 1-7.