생화학분자생물학회

플라즈모닉 히팅 기술을 이용한 휴대용 디지털 분자진단 시스템 개발

Plasmonic heating-based portable digital PCR system

Lab on a Chip 20:3560-3568, 2020

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연구배경

PCR (polymerase chain reaction) 기술은 타겟 핵산의 염기서열 중 특정 구간을 증폭시켜 진단하는 분자진단 기술로서, 신종 코로나 바이러스와 같은 대규모 감염성 질환이 연속적으로 발생함에 따라 중요성이 대두되고 있다 (1). 하지만, 기존 개발된 PCR 혹은 real-time PCR 기술은 낮은 감도와 위양성/위음성의 오류를 내포하고 있으며, standard curve 기반의 정량분석으로 인한 한계점은 지니고 있다 (2-3). 이에 반해, 디지털 PCR 기술은 기존 기술 대비 높은 감도와 정확도를 나타내며, 절대 정량분석이 가능함에 따라 차세대 진단기술로서 주목받고 있다 (4).

 디지털 PCR 기술은 microwell 혹은 droplet 등을 통해 샘플을 수천~수만 개의 파티션으로 분획하여 DNA를 증폭시킨다 (5-6). 이에 따라, 타겟 DNA가 존재하는 곳 (“1”)과 존재하지 않은 곳 (“0”)으로 나뉘게 되며, 형광 신호 분석 및 포아송 분포도 (Poisson’s distribution)를 기반으로 해당 비율을 역계산하면 초기 주입된 샘플의 농도를 분석할 수 있다. PCR 과정이 각 파티션에서 진행됨에 따라, inhibitor에 높은 저항성을 지니며, 더욱 신뢰도가 높은 정량 분석결과를 얻을 수 있다 (7). 이러한 디지털 PCR의 우수성으로 인해, 현재까지 많은 시스템들이 개발되어 왔지만, 분석을 위해 사용되는 기기들의 높은 전력소모와 복잡한 분석과정 등으로 인해 현장진단 (point-of-care testing, POCT) 적용에 어려움을 겪고 있다 (8-9).

 본 논문에서는 현장진단 적용을 위한 플라즈모닉 히팅 기반의 디지털 PCR 시스템을 개발하였다. 해당 시스템은 저 전력에서도 작동 가능하며, 높은 히팅 성능을 나타내어 분석 시간을 단축시킬 수 있다. 또한, LED를 기반으로 구성되어 시스템을 소형화시켰으며, 낮은 비용으로 제작할 수 있도록 설계하였다. 마지막으로, PDMS (polydimethylsiloxane) 및 PMMA(polymethylmethacrylate) microwell array와 결합하여 디지털 PCR을 진행하였고, 정량 검출 성능을 비교 분석하였다.

연구결과

1. 플라즈모닉 히팅 기반 디지털 PCR 시스템 개발

플라즈모닉 히팅 기반의 디지털 PCR 시스템은 싱글 보드 컴퓨터 (Raspberry Pi 4), 2개의 커스텀 PCB (printed circuit board) 및 쿨링 팬으로 구성되었다. 본 시스템은 소형화된 크기 (9.7x5.6x4.1 cm)로 제작되었으며, 낮은 전력 소모 (4.5W)로 인해 휴대용 보조배터리를 이용하여 작동될 수 있다. 플라즈모닉 히팅을 위해 120 nm 두께의 금 박막 레이어와 4개의 blue LED (λ≈450 nm)가 각각 PCB에 탑재되었다. ADC (analogue digital converter) 및 Wheatstone bridge를 이용하여 저항 기반의 온도 측정이 이뤄졌으며, MOSFET (metal oxide semiconductor field-effect transistor)을 이용한 PWM (pulse-width modulation) 작동으로 금 박막 레이어의 온도가 제어되었다. 본 시스템의 온도 제어 성능을 평가한 결과, 최대 10.7±0.6 °C/sec의 heating rate 및 8±0.4 °C/sec의 cooling rate를 기록하였으며, 모든 구간에서 ± 1 °C/sec 미만의 오차가 나타났다. 적외선 카메라 이미지를 분석한 결과, 금 박막 레이어 전반적으로 균일한 온도 분포도가 나타났고, 반복 cycle 작동 중에도 히팅 및 쿨링 성능이 유지되었다. 마지막으로, 20,000 mAh 용량의 보조배터리를 이용하여 반복 PCR 과정을 수행하였고, 한 번의 충전으로 최대 25회 작동이 가능함을 확인하였다. 결과적으로, 플라즈모닉 히팅 기반의 디지털 PCR 시스템은 소형화된 크기 및 낮은 전력의 사용으로 높은 온도 제어 성능을 나타내어 감염성 질환이 발생하는 현장에서 활용 가능한 형태로 개발되었다.

2. PDMS microwell array 기반 디지털 PCR 분석

디지털 PCR 분석을 위해 사용된 PDMS microwell array는 22,080개의 microwell (20 μm diameter) 및 64개의 panel로 구성되었다. PCR 과정에서 발생하는 증발현상을 방지하기 위해 150 μm 두께의 멤브레인 형태로 제작되었고, cover slide 및 PCR sealing tape를 통해 결합되었다. 해당 array는 98.8 %의 높은 filling efficiency를 나타내었으며, PCR 과정 후에도 94.9%의 microwell에 샘플이 잔존하였다. Microwell 위치 검출을 위해 reference dye가 사용되었고, Hough-based 이미지 분석 알고리즘을 통해 형광 신호 분석이 진행되었다. 농도별로 희석된 DNA 샘플을 이용하여 디지털 PCR 분석을 진행한 결과, DNA 농도가 증가함에 따라 positive signal이 증가하였고, 전 구간에서 높은 정확도의 정량 분석이 이뤄졌다. PDMS microwell array 기반 디지털 PCR 분석을 통해 분석 가능한 최저 농도는 101±14 copies/μL, 최대 농도는 264,592±20,449 copies/μL 로 나타났다. 모든 측정결과가 이론적 추산 값과 상응하여 microwell 사이의 crosstalk나 이미지 분석 알고리즘으로 인한 오류가 나타나지 않았음을 확인하였다. 

3. PMMA microwell array 기반 디지털 PCR 분석

플라즈모닉 히팅 기반 디지털 PCR 시스템의 현장진단 적용 가능성을 테스트하기 위해 플라스틱 PMMA microwell array을 이용한 디지털 PCR 분석을 진행하였다. PMMA microwell array는 플라스틱 사출 성형을 기반으로 제작되었으며, 8,100개의 microwell (80 μm diameter)로 구성되었다. PMMA 디바이스는 99.2 %의 filling efficiency를 기록하였고, PCR 과정 후 98.8 %의 microwell에 샘플이 잔존하여 PDMS 디바이스 보다 더욱 효과적으로 샘플 증발을 억제하였다. DNA 샘플을 이용한 디지털 PCR 분석 결과, 최소 12±0.7 copies/μL, 최대 25,889±737 copies/μL의 농도에서 정량 분석이 가능하였다. PDMS 대비 증가한 단일 microwell 부피로 인해 분석 가능한 농도구간이 낮아졌고, 전 구간에서 95% 이상의 정량 분석 정확도를 기록하였다. 해당 결과를 통해, 본 연구에서 제안한 플라즈모닉 히팅 기반의 디지털 PCR 시스템은 대량생산 가능한 PMMA microwell array와 결합되어 현장진단에 적용 가능한 형태로 개발되었음을 확인하였다.

연구 성과 및 의의

디지털 PCR 기술은 기존 기술 대비 우수한 민감도 및 정확도를 나타내어 차세대 분자진단 기술로 대두되고 있다. 하지만, 기존의 디지털 PCR 시스템의 고가의 장비와 높은 전력 소모, 느린 분석 시간으로 인해 현장에서 활용되는 데 한계를 보이고 있다. 이에 따라 기존의 단점을 극복하고 현장에서 활용 가능한 디지털 PCR 시스템의 개발이 요구되고 있다. 본 연구에서 개발한 플라즈모닉 히팅 기반의 디지털 PCR 시스템은 소형화된 크기 및 낮은 전력소모로 작동이 가능하며, 높은 히팅 효율을 나타내어 분석 시간을 단축할 수 있다. 따라서 본 시스템은 자원이 제한된 현장에서 신속하게 진단을 수행하여 감염성 질환의 확산 방지에 기여할 수 있다.

참고문헌

1. Petralia, S., S. Conoci (2017) PCR Technologies for Point of Care Testing: Progress and Perspectives. ACS Sens 2, 876-891.

2. Diehl, F., et al. (2008) Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics. Nat Med 14, 985-990.

3. Warren, L., et al. (2006) Transcription factor profiling in individual hematopoietic progenitors by digital RT-PCR. Proc Nat Acad Sci 103, 17807-17812.

4. Vogelstein, B. and K.W. Kinzler (1999) Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96, 9236-9241.

5. DeJournette, C.J., et al. (2013) Creating biocompatible oil-water interfaces without synthesis: direct interactions between primary amines and carboxylated perfluorocarbon surfactants. Anal Chem 85, 10556-10564.

6. Li, H., et al. (2019) Versatile digital polymerase chain reaction chip design, fabrication, and image processing. Sens Actuators B Chem 283, 677-684.

7. Nixon, G., et al. (2014) Comparative Study of Sensitivity, Linearity, and Resistance to Inhibition of Digital and Nondigital Polymerase Chain Reaction and Loop Mediated Isothermal Amplification Assays for Quantification of Human Cytomegalovirus. Anal Chem 86, 4387-4394.

8. Gou, T., et al. (2018) Smartphone-based mobile digital PCR device for DNA quantitative analysis with high accuracy. Biosens Bioelectron 120, 144-152.

9. Son, J.H., et al. (2015) Ultrafast photonic PCR. Light Sci Appl 4, e280.​