생화학분자생물학회

생쥐발생과정에서 물리적으로 붙어있는 세포 시퀀싱을 활용한 이웃특이적인 유전자발현 규명

Neighbor-specific gene expression revealed from physically interacting cells during mouse embryonic development

PNAS 120(2): e2205371120, 2023 

원경재 Cedars-Sinai Medical Center, Associate Professor E-mail: KyoungJae.Won@cshs.org

김준일 숭실대학교 의생명시스템학부 조교수 E-mail: junilkim@ssu.ac.kr

연구배경

 본 연구에서는 PIC-seq을 사용하여 생쥐 배아의 발생과정에서 세포의 접촉에 의한 유전자발현을 파악하고자 하였다. 이를 위해 생쥐 배아발생단계 (E7.5, E8.5, E9.5)에서 내배엽과 그 주변을 분리한 후에 단일세포전사체 데이터와 PIC-seq 데이터를 얻게 되었고 생물정보학적인 방법으로 확정내배엽세포(Definitive endoderm)와 신경전구세포(neural progenitor)가 접촉하고 있을 때 발현이 유도되는 유전자를 발굴할 수 있었다.​

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3. 접촉특이적 유전자발현의 검증

 PIC-seq 데이터를 통해 찾아낸 접촉특이적인 마커유전자가 생쥐배아에서 뿐만아니라 in vitro에서도 접촉을 한 경우에 발현이 올라가는지 밝히기 위해 검증 실험을 수행하였다. 먼저 생쥐배아 E8.5에서 NP와 DE 세포를 FACS를 이용하여 분리한 후에 배양을 진행한 각각의 그룹(Monoculture NP, DE)이 있고 분리된 NP와 DE 세포를 다시 섞어서 함께 배양을 한 후에 다시 분리하여 세포(Co-culture NP, DE)그룹을 얻었다. 각각의 그룹에서 NP가 DE와 접촉했을 때 발현하는 마커유전자인 Lhx5와 Nkx2-1 그리고 DE가 NP와 접촉했을 때 발현하는 마커유전자인 Gsc와 Rax의 발현을 측정해보았다. 그 결과 놀랍게도 Lhx5와 Nkx2-1은 Co-culture NP에서만 발현을 하고 Gsc와 Rax는 Co-culture DE에서만 발현하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 PIC-seq 데이터분석을 통해 찾은 접촉특이적 유전자가 실제로 두 종류의 세포의 접촉으로 인해 그 발현이 올라가는 것을 의미한다.

그림 3. 접촉특이적 유전자발현의 검증. Lhx5, Nkx2-1은 NP세포 중에서 DE와 함께 배양된 경우에 발현이 올라가고 Gsc, Rax는 DE세포 중에서 NP와 함께 배양된 경우에 발현이 올라가는 것을 확인하였다. 

연구 성과 및 의의

 세포는 이웃하는 세포의 다양한 상태에 영향을 받는다(14, 15). 특히, 배아발생 동안에 인접한 세포와의 관계는 세포의 시공간적인 위치에 따른 유전자발현을 결정하는데 핵심적인 요소라고 할 수 있다. 본 연구에서는 세포가 서로 접촉하고 있을 때 독특한 유전자발현 패턴을 보이는지 만약에 그런 발현패턴이 있다면 어떻게 찾을 수 있을지에 대한 질문을 던졌다. 이에 답하기 위해서 PIC-seq이라는 기술을 활용하여 이웃하는 두 세포의 발현데이터를 얻을 수 있었고 머신러닝 기법을 적용하여 접촉에 특이적인 유전자를 예측할 수 있었다. 또한 예측된 유전자가 두 종류의 세포가 만나는 위치에 특이적으로 발현한다는 것 보여줌으로써 유전자의 역할을 검증할 수 있었다. 이러한 접근방식은 세포 간의 통신을 연구할 때 ligand-receptor 데이터베이스를 사용하는 기존의 방식과는 달리 편향되지 않은 탐색방식이라고 할 수 있다. 실제로 PIC-seq을 이용해서 예측한 접촉특이적 발현을 보이는 유전자들은 ligand-receptor 데이터베이스를 활용한 CellPhoneDB(9)라는 툴의 결과와는 상이한 것을 확인할 수 있었다.

 생쥐의 배아에서 접촉특이적인 유전자발현을 검증하기는 했지만 해당 유전자의 발현이 다른 원인에 의해서 발현하는 것인지 접촉에 의해서 발현하는 것인지 구별하기는 힘들기 때문에 새로운 실험을 고안하였다. 다시 말해, 접촉특이적인 발현을 보이는 유전자가 실제로 접촉에 의해서 발현이“유발”되는지를 밝히기 위해 두 종류의 세포를 함께 배양함으로써 PIC-seq 데이터분석에서 예측한 Lhx5, Nkx2-1, Gsc, Rax 유전자가 접촉에 의해서 유전자발현이 유발되는지를 확인할 수 있었다.

 본 연구에서 택한 연구전략은 세포간의 통신 (cell-cell communication)을 공부하는 새로운 방법으로써 다세포생물의 조직이 구성되어가는 과정을 이해하는데 중요한 단서를 제공할 수 있을 것이다. 공간전사체 기술이 점점 발전하면서 이웃하는 세포의 발현을 직접적으로 측정할 수 있게 되었지만 공간전사체는 세포의 구획을 나누는 문제 3차원 공간에서 조직을 나눌 때 발생하는 문제가 남아있기 때문에 단일세포 데이터와는 차이가 생기게 된다. 하지만 PIC-seq 데이터는 단일세포 데이터와 근본적으로 차이가 없기 때문에 단일세포와 두세포를 비교하여 유전자를 발굴하는데 더 공정한 비교를 제시할 수 있다. 공간전사체 기술과 PIC-seq 기술이 접목된다면 이웃하는 세포들 간의 상호작용을 이해하는데 큰 시너지가 있을 것으로 기대된다.​ 

참고문헌

1. R. K. L. Larue, C. Antos, S. Butz, O. Huber, V. Delmas, M. Dominis, A role for cadherins in tissue formation | Development. Development 122, 3185–3194 (1996).

2. O. Shaya, et al., Cell-Cell Contact Area Affects Notch Signaling and Notch-Dependent Patterning. Dev. Cell 40, 505-511.e6 (2017).

3. R. O. Stephenson, Y. Yamanaka, J. Rossant, Disorganized epithelial polarity and excess trophectoderm cell fate in preimplantation embryos lacking E-cadherin. Development 137, 3383–3391 (2010).

4. M. D. Yoder, B. M. Gumbiner, Axial protocadherin (AXPC) regulates cell fate during notochordal morphogenesis. Dev. Dyn. 240, 2495–2504 (2011).

5. P. Thomas, R. Beddington, Anterior primitive endoderm may be responsible for patterning the anterior neural plate in the mouse embryo. Curr. Biol. 6, 1487–1496 (1996).

6. S. Nowotschin, et al., The emergent landscape of the mouse gut endoderm at single-cell resolution. Nature 569, 361–367 (2019).

7. J. Cao, et al., The single-cell transcriptional landscape of mammalian organogenesis. Nature 566 (2019).

8. B. Pijuan-Sala, et al., A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis. Nature 566, 490–495 (2019).

9. M. Efremova, M. Vento-Tormo, S. A. Teichmann, R. Vento-Tormo, CellPhoneDB: inferring cell–cell communication from combined expression of multi-subunit ligand–receptor complexes. Nat. Protoc. 15, 1484–1506 (2020).

10. J. C. Boisset, et al., Mapping the physical network of cellular interactions. Nat. Methods 15, 547–553 (2018).

11. K. B. Halpern, et al., Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells. Nat. Biotechnol. 36, 962–970 (2018).

12. B. M. Szczerba, et al., Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression. Nature 566, 553–557 (2019).

13. A. Giladi, et al., Dissecting cellular crosstalk by sequencing physically interacting cells. Nat. Biotechnol. 38 (2020).

14. V. Barone, et al., An Effective Feedback Loop between Cell-Cell Contact Duration and Morphogen Signaling Determines Cell Fate. Dev. Cell 43, 198–211 (2017).

15. E. Hannezo, C. P. Heisenberg, Mechanochemical Feedback Loops in Development and Disease. Cell 178, 12–25 (2019).​ 

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