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우수논문소개

생쥐발생과정에서 물리적으로 붙어있는 세포 시퀀싱을 활용한 이웃특이적인 유전자발현 규명

  • 작성자

    김준일 (숭실대학교 의생명시스템학부 조교수)
  • 작성일자

    2023-07-07
  • 조회수

    1971

생쥐발생과정에서 물리적으로 붙어있는 세포 시퀀싱을 활용한 이웃특이적인 유전자발현 규명

Neighbor-specific gene expression revealed from physically interacting cells during mouse embryonic development

PNAS 120(2): e2205371120, 2023 

 

 

원경재 Cedars-Sinai Medical Center, Associate Professor E-mail: KyoungJae.Won@cshs.org

김준일 숭실대학교 의생명시스템학부 조교수 E-mail: junilkim@ssu.ac.kr

 

연구배경



 세포 간의 통신 방법 (cell-cell communication) 중의 하나인 세포 간의 접촉은 다세포생명체의 발생과정에서 세포가 운명을 결정하는데 중요하게 작용한다(1–4). 배아의 발생과정에서 특정 조직을 제거했을 때 인접한 세포의 운명이 바뀌는 실험 결과는 이를 뒷받침하는 결과이다(5).하지만 배아의 발생패턴을 이해하는 열쇠가 될 수 있는 이웃하는 조직에 의한 유전자발현의 변화를 파악한다는 것은 기술적으로 도전적인 일이라고 할 수 있다.
 단일세포전사체 기술은 발생과정에서 분화되는 세포유형을 동정하고 세포의 발생궤적을 파악하는데 성공적으로 적용되고 있다(6–8). 문제는 단일세포전사체 기술에서는 모든 세포를 분리하기 때문에 이웃하는 세포의 정보가 소실된다는데 있다. 최근 개발된 많은 생물정보학 기법들은 단일세포전사체 데이터로부터 두 세포유형에서 평균적으로 발현하는 receptor와 ligand의 쌍을 찾아내는 방법으로 세포 간의 통신을 분석할 수 있게 한다(9). 하지만 이러한 방법들은 데이터베이스에 등재된 receptor-ligand 쌍에 국한되기 때문에 세포유형 간의 접촉에 의해 발생되는 유전자발현의 변화를 분석하는 데는 한계가 있다.
 이와 같은 한계를 극복하기 위해 개발된 방법이 물리적으로 상호작용하는 두 세포(PIC: Physically interacting cell)를 얻은 후에 단일세포전사체 기술을 이용해서 데이터를 얻는 방법(PIC-seq)이다(10–13). 다시 말해서 원래 단일세포전사체 데이터에서 세포를 모두 분리하는 방법을 변형하여 세포를 약하게 분리한 후에 FACS를 이용하여 얻어진 붙어있는 두 세포를 시퀀싱하여 단일세포가 아니라 두세포 전사체 데이터를 얻는 전략이다.

 본 연구에서는 PIC-seq을 사용하여 생쥐 배아의 발생과정에서 세포의 접촉에 의한 유전자발현을 파악하고자 하였다. 이를 위해 생쥐 배아발생단계 (E7.5, E8.5, E9.5)에서 내배엽과 그 주변을 분리한 후에 단일세포전사체 데이터와 PIC-seq 데이터를 얻게 되었고 생물정보학적인 방법으로 확정내배엽세포(Definitive endoderm)와 신경전구세포(neural progenitor)가 접촉하고 있을 때 발현이 유도되는 유전자를 발굴할 수 있었다.​

  

연구결과

 

1. 생쥐배아에서 얻은 PIC-seq 데이터

 

 세포의 접촉에 의한 유전자발현의 변화를 탐구하기 위해서 먼저 생쥐의 발생과정 중 E7.5, E8.5, E9.5 세 개의 시간대의 배아에서 단일세포전사체 데이터(그림1A)와 PIC-seq 데이터(그림1B)를 얻었다. 그리고 PIC-seq 데이터가 어떤 두 세포의 조합인지를 알아내기 위해서 머신러닝 기법의 하나인 SVM(Support Vector Machine)으로 분류하였다. 그림1의 heatmap에서 알 수 있듯이 단일세포전사체 데이터는 세포유형 특이적인 마커유전자가 각각의 클러스터에서 특이적으로 발현하는 반면에 PIC-seq 데이터는 두 개 이상의 마커유전자를 동시에 발현하는 양상을 확인할 수 있다. 예를 들어 그림1B의 NP+DE(NP: 신경전구세포와 DE: 확정내배엽세포의 조합)의 경우 NP 마커유전자와 DE 마커유전자가 동시에 발현하고 있다.​
그림 1. 생쥐배아에서 얻은 단일세포전사체와 PIC-seq 데이터

2. PIC-seq 데이터를 통해 제시된 세포접촉 특이적인 유전자 발현양상

 

 PIC-seq 데이터로부터 세포접촉 특이적으로 발현하는 유전자를 찾기 위해서 NP+DE 조합의 PIC-seq 데이터와 단일세포전사체로부터 재구성한 가상의 NP+DE 데이터를 비교하였다. 그 결과 NP 즉, 신경전구세포와 DE 확정내배엽세포가 접촉할 때 발현이 증가되는 유전자를 찾을 수 있었다(그림2A). 문제는 찾아낸 유전자가 NP와 DE 둘 중에 어떤 세포에서 발현하는지는 알 수 없다는 점이다. 이를 알아내기 위해서 다시 단일세포전사체 데이터의 각 세포들을 SVM을 활용하여 분류하여 각 세포가 원래 조직에 있었을 때 어떤 세포가 접촉하고 있었을지를 예측해보았다. 그 결과 NP를 DE와 접촉하고 있었을 세포집단, NC (Notochord)와 접촉하고 있었을 세포집단, 그리고 NP와 접촉하고 있었을 세포집단으로 분류할 수 있었고(그림2B위) DE를 NP와 접촉하고 있었을 세포집단과 DE와 접촉하고 있었을 세포집단으로 분류할 수 있었다(그림2B아래). 분류를 하고 보니. 앞선 분석에서 찾아낸 NP+DE 접촉특이적인 유전자를 NP세포 중에서 DE와 접촉한 세포를 구별하는데 사용된 Lhx5, Pou3f1, Mest, Nkx2-1 등과 DE세포 중에서 NP와 접촉한 세포를 구별하는데 사용된 Gsc, Rax, Irx5 등의 유전자로 구별할 수 있었다.
 이렇게 예측한 세포접촉에 특이적인 마커유전자를 검증하기 위해서 독립적인 생쥐배아 E8.5에서 NP와 DE가 접촉하고 있는 부위의 유전자를 확인해보았다. 그 결과 NP세포 중에서 DE와 만나는 영역에 있는 세포들이 Nkx2-1 유전자를 발현하고 있는 것을 알 수 있었다(그림2C). 이 관찰을 통해 PIC-seq 데이터로 찾아낸 접촉특이적인 유전자가 두 세포유형이 접촉하는 영역에서 강하게 발현하는 것을 알 수 있었다.



그림 2. PIC-seq 데이터분석을 통해 알아낸 접촉특이적으로 발현하는 유전자

 

3. 접촉특이적 유전자발현의 검증


 PIC-seq 데이터를 통해 찾아낸 접촉특이적인 마커유전자가 생쥐배아에서 뿐만아니라 in vitro에서도 접촉을 한 경우에 발현이 올라가는지 밝히기 위해 검증 실험을 수행하였다. 먼저 생쥐배아 E8.5에서 NP와 DE 세포를 FACS를 이용하여 분리한 후에 배양을 진행한 각각의 그룹(Monoculture NP, DE)이 있고 분리된 NP와 DE 세포를 다시 섞어서 함께 배양을 한 후에 다시 분리하여 세포(Co-culture NP, DE)그룹을 얻었다. 각각의 그룹에서 NP가 DE와 접촉했을 때 발현하는 마커유전자인 Lhx5와 Nkx2-1 그리고 DE가 NP와 접촉했을 때 발현하는 마커유전자인 Gsc와 Rax의 발현을 측정해보았다. 그 결과 놀랍게도 Lhx5와 Nkx2-1은 Co-culture NP에서만 발현을 하고 Gsc와 Rax는 Co-culture DE에서만 발현하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 PIC-seq 데이터분석을 통해 찾은 접촉특이적 유전자가 실제로 두 종류의 세포의 접촉으로 인해 그 발현이 올라가는 것을 의미한다.

 

그림 3. 접촉특이적 유전자발현의 검증. Lhx5, Nkx2-1은 NP세포 중에서 DE와 함께 배양된 경우에 발현이 올라가고 Gsc, Rax는 DE세포 중에서 NP와 함께 배양된 경우에 발현이 올라가는 것을 확인하였다. 

 

연구 성과 및 의의

 

 세포는 이웃하는 세포의 다양한 상태에 영향을 받는다(14, 15). 특히, 배아발생 동안에 인접한 세포와의 관계는 세포의 시공간적인 위치에 따른 유전자발현을 결정하는데 핵심적인 요소라고 할 수 있다. 본 연구에서는 세포가 서로 접촉하고 있을 때 독특한 유전자발현 패턴을 보이는지 만약에 그런 발현패턴이 있다면 어떻게 찾을 수 있을지에 대한 질문을 던졌다. 이에 답하기 위해서 PIC-seq이라는 기술을 활용하여 이웃하는 두 세포의 발현데이터를 얻을 수 있었고 머신러닝 기법을 적용하여 접촉에 특이적인 유전자를 예측할 수 있었다. 또한 예측된 유전자가 두 종류의 세포가 만나는 위치에 특이적으로 발현한다는 것 보여줌으로써 유전자의 역할을 검증할 수 있었다. 이러한 접근방식은 세포 간의 통신을 연구할 때 ligand-receptor 데이터베이스를 사용하는 기존의 방식과는 달리 편향되지 않은 탐색방식이라고 할 수 있다. 실제로 PIC-seq을 이용해서 예측한 접촉특이적 발현을 보이는 유전자들은 ligand-receptor 데이터베이스를 활용한 CellPhoneDB(9)라는 툴의 결과와는 상이한 것을 확인할 수 있었다.

 생쥐의 배아에서 접촉특이적인 유전자발현을 검증하기는 했지만 해당 유전자의 발현이 다른 원인에 의해서 발현하는 것인지 접촉에 의해서 발현하는 것인지 구별하기는 힘들기 때문에 새로운 실험을 고안하였다. 다시 말해, 접촉특이적인 발현을 보이는 유전자가 실제로 접촉에 의해서 발현이“유발”되는지를 밝히기 위해 두 종류의 세포를 함께 배양함으로써 PIC-seq 데이터분석에서 예측한 Lhx5, Nkx2-1, Gsc, Rax 유전자가 접촉에 의해서 유전자발현이 유발되는지를 확인할 수 있었다.

 본 연구에서 택한 연구전략은 세포간의 통신 (cell-cell communication)을 공부하는 새로운 방법으로써 다세포생물의 조직이 구성되어가는 과정을 이해하는데 중요한 단서를 제공할 수 있을 것이다. 공간전사체 기술이 점점 발전하면서 이웃하는 세포의 발현을 직접적으로 측정할 수 있게 되었지만 공간전사체는 세포의 구획을 나누는 문제 3차원 공간에서 조직을 나눌 때 발생하는 문제가 남아있기 때문에 단일세포 데이터와는 차이가 생기게 된다. 하지만 PIC-seq 데이터는 단일세포 데이터와 근본적으로 차이가 없기 때문에 단일세포와 두세포를 비교하여 유전자를 발굴하는데 더 공정한 비교를 제시할 수 있다. 공간전사체 기술과 PIC-seq 기술이 접목된다면 이웃하는 세포들 간의 상호작용을 이해하는데 큰 시너지가 있을 것으로 기대된다. 

 

참고문헌

 

1. R. K. L. Larue, C. Antos, S. Butz, O. Huber, V. Delmas, M. Dominis, A role for cadherins in tissue formation | Development. Development 122, 3185–3194 (1996).

2. O. Shaya, et al., Cell-Cell Contact Area Affects Notch Signaling and Notch-Dependent Patterning. Dev. Cell 40, 505-511.e6 (2017).

3. R. O. Stephenson, Y. Yamanaka, J. Rossant, Disorganized epithelial polarity and excess trophectoderm cell fate in preimplantation embryos lacking E-cadherin. Development 137, 3383–3391 (2010).

4. M. D. Yoder, B. M. Gumbiner, Axial protocadherin (AXPC) regulates cell fate during notochordal morphogenesis. Dev. Dyn. 240, 2495–2504 (2011).

5. P. Thomas, R. Beddington, Anterior primitive endoderm may be responsible for patterning the anterior neural plate in the mouse embryo. Curr. Biol. 6, 1487–1496 (1996).

6. S. Nowotschin, et al., The emergent landscape of the mouse gut endoderm at single-cell resolution. Nature 569, 361–367 (2019).

7. J. Cao, et al., The single-cell transcriptional landscape of mammalian organogenesis. Nature 566 (2019).

8. B. Pijuan-Sala, et al., A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis. Nature 566, 490–495 (2019).

9. M. Efremova, M. Vento-Tormo, S. A. Teichmann, R. Vento-Tormo, CellPhoneDB: inferring cell–cell communication from combined expression of multi-subunit ligand–receptor complexes. Nat. Protoc. 15, 1484–1506 (2020).

10. J. C. Boisset, et al., Mapping the physical network of cellular interactions. Nat. Methods 15, 547–553 (2018).

11. K. B. Halpern, et al., Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells. Nat. Biotechnol. 36, 962–970 (2018).

12. B. M. Szczerba, et al., Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression. Nature 566, 553–557 (2019).

13. A. Giladi, et al., Dissecting cellular crosstalk by sequencing physically interacting cells. Nat. Biotechnol. 38 (2020).

14. V. Barone, et al., An Effective Feedback Loop between Cell-Cell Contact Duration and Morphogen Signaling Determines Cell Fate. Dev. Cell 43, 198–211 (2017).

15. E. Hannezo, C. P. Heisenberg, Mechanochemical Feedback Loops in Development and Disease. Cell 178, 12–25 (2019).