생화학분자생물학회

다양한 연구 분야에 활용되는 인체 유래 장 오가노이드

장경구

New York University

Kyungku.Jang@nyulangone.org

1. 서론

 오가노이드 (organoid)는 줄기 세포에서 유래해 자가 조직화된 3차원 클러스터로서 뇌, 망막, 간 또는 장과 같은 원래 기관의 기능, 분자 및 세포 이질성을 유지할 수 있다 (1). 가장 많은 연구가 진행된 장 오가노이드 (intestinal organoid)는 장 성체 줄기 세포 (adult stem cells) 로부터 유래되어 장 상피의 구조와 유사하게 분화되므로 유래한 세포의 기능 및 유전적 정보를 보존하면서 자가 재생 및 조직화가 가능해 생체은행으로 장기간 보관 및 재사용이 가능하다 (1). 이와 더불어 실험 목적에 따라 3차원 형태의 장 오가노이드를 단층으로 배양할 수 있기 때문에 장 오가노이드 배양 시스템은 장의 세포 다양성을 반영할 수 없는 기존 세포주의 많은 한계를 극복할 수 있다. 

 장 오가노이드 기술은 질병 모델링 (2), 치료제 개발 (3), 숙주-미생물 상호작용 (4), 생체 분자 전달 (5) 등 다양한 분야에 활용되고 있다. 최근에는 CRISPR/Cas9와 같은 게놈 편집 기술을 통해 용이해진 장 오가노이드의 유전자 조작을 활용한 다목적 스크리닝 시스템, 즉 gut-on-chip 연구가 등장했다 (6). 본 기고에서는 장 오가노이드를 배양하는 원리와 장 오가노이드의 이질성을 활용한 연구로 1) 장 점막 분화 기전 규명, 2) 미생물 감염 모델 구축, 3) 염증성 장 질환 치료제의 반응성 예측을 소개하고자 한다. 

2. 본론

2-1. 장 오가노이드의 배양 원리

 장 오가노이드는 특정 기관으로만 발달할 수 있는 성체 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포 (induced pluripotent stem cells), 배아 줄기 세포 (embryonic stem cells)에서 생성할 수 있다 (7). 줄기 세포는 소장의 융모 (villi) 및 크립트 (crypt) 등으로 구성된 3차원 구조를 형성하며 장기간 자가 재생 및 조직화가 가능하다. 장 오가노이드는 초기에 작은 포낭으로 시작해 발아와 유사한 형태로 생장한다. 발아 형태 내부는 ISC와 Paneth 세포가 존재하는 크립트가 장 세포 (enterocyte), 장내 분비 (enteroendocrine cell) 및 술잔 세포 (goblet cell)로 분화되어 융모와 유사한 형태를 보인다 (그림 1a). 

그림 1. 장 오가노이드의 생성과 분화를 위해서는 다양한 생장 인자 및 사이토카인이 요구된다. a, 장 오가노이드는 초기에 작은 포낭으로 시작해 발아와 유사한 형태로 성장하여 Paneth 세포 및 분비 세포로 분화하며, 장 오가노이드의 생성 및 성장은 줄기 세포 기능을 유지하고 분화를 촉진하기 위해 생체 내 줄기 세포의 신호 경로와 유사한 생장 인자인 Wnt-3a, EGF, Noggin, R-Spondin 1이 요구된다. Noggin은 LDN-193189로, R-Spondin 1은 RS-246204로 대체될 수 있다. CHIR99021과 valproic caid은 Lgr5⁺ ISC의 활성을 유지시킴으로써 미분화 상태의 장 오가노이드의 생성을 유도한다. 반면 DAPT와 IWP-2는 장 오가노이드의 분화를 유도한다. b, 장 오가노이드는 다양한 생장 인자에 의해 특정 세포로 분화될 수 있다. 만능 줄기 세포로 생성된 장 오가노이드는 IL-2에 의해 분화와 완성이 유도된다. 뿐만 아니라 IGF-1과 FGF-2는 분비 세포의 분화를 강하게 유도하며, IL-17A는 Lgr5⁺ ISC의 ATOH1 발현을 유도해 분비 세포의 분화를 촉진한다. 반면 IL-22는 Lgr5⁺ ISC를 활성화시켜 오가노이드의 생성을 증가시키는 것으로 보고 되었으나, TA 세포의 수를 증가시키거나 Paneth 세포의 분화를 촉진하는 기능이 있는 것으로 보고 되었다. 따라서 IL-22가 장 오가노이드의 분화에 미치는 영향은 후속 연구가 필요하다. 

 장 오가노이드를 배양하고 유지하기 위한 주요 성분으로 세포외 기질 (extracellular matrix, ECM)과 생장 인자 (growth factors)가 포함된 배양 배지가 있다 (8). 세포외 기질은 줄기 세포가 성장 및 분화할 수 있도록 3차원 구조를 유지시킬 뿐만 아니라 생화학적 신호를 제공한다. 장 오가노이드의 생성 및 성장은 줄기 세포 기능을 유지하고 분화를 촉진하기 위해 생체 내 줄기 세포의 신호 경로와 유사한 생장 인자의 종류 및 농도가 포함된 배양 배지가 요구된다 (9). 주요 성분으로 Wnt-3a (W), 표피 성장 인자 (Epidermal growth factor, EGF (E)), Noggin (N), R-Spondin 1 (R)이 있으며, 이는 WENR 배지로 불린다 (그림 1a) (9). 위 생장 인자들은 Wnt, BMP (bone morphogenetic protein) 및 Notch와 같은 줄기 세포 신호를 조절해 장 줄기 세포 (intestinal stem cells, ISC) 증식 및 모든 종류의 장 상피 세포의 분화를 유도한다. Wnt-3a는 대장 오가노이드 생성 및 성장에 필요하나, 소장 오가노이드에 대해서는 추가 연구가 필요하다. 

 이 외에도 줄기 세포를 유지시키거나 특정 세포로 분화되도록 유도하는 추가 생장 인자들이 보고 되었다 (10). CHIR99021 (GSK-3 inhibitor)과 valproic acid는 Lgr5⁺ ISC를 활성을 유지함으로써 미분화 상태의 장 오가노이드를 생성한다 (그림 1a). 반대로 DAPT와 IWP-2를 배지에 추가함으로써 ISC를 Paneth 세포, 장 세포 및 분비 세포인 술잔 세포와 장내 분비 세포로 분화 시킬 수 있다 (그림 1a) (10). 이 외에도 M 세포 및 Tuft 세포와 같은 장 상피 세포의 분화도 확인 되었다. 또, 주요 생장 인자인 Noggin과 R-Spondin 1을 LDN-193189 (ALK2 and ALK3 inhibitor)과 RS-246204로 각각 대체 가능한 것으로 보고 되었다 (그림 1a) (11, 12). 

 위와 같이 배양 배지의 조성은 많은 연구를 통해 정의되었으나 각 연구마다 구성 성분 및 농도가 다르며, 원하는 결과를 얻기 위한 효과적인 농도와 처리 시간을 실험적으로 결정할 필요가 있다. 

2-2. 장 점막 분화 기전 규명

 장 오가노이드는 배지의 생장 인자의 농도 및 성분을 변화함으로써 분화 과정을 조절할 수 있으며, 배양 조건의 다양화를 통해 장 오가노이드 분화에 기여하는 인자를 규명 할 수 있다 (9). 초기에는 장 오가노이드의 배양 및 계대를 용이하게 하는 생장 인자를 동정하는 연구가 주를 이루었으나 최근에는 실제 장이 분화되는 환경과 유사한 조건에서 goblet cell 및 Paneth cell 등의 세포로 분화하는 기전을 규명하는 연구가 진행되고 있다 (13). 특히 ISC에 물리적으로 신호를 전달할 수 있는 면역 세포가 분비할 수 있는 IL-2, IL17, IL-22와 같은 사이토카인 (cytokine)이 장 오가노이드의 분화를 촉진하는 것이 알려져 있다 (그림 1b) (14-18).

 Toshiro Sato group은 장상피하 기질 세포 (intestinal subepithelial stromal cells)에서 분비하는 receptor tyrosine kinase (RTK) 라이간드 (ligand)를 스크리닝해 분비 세포의 분화를 촉진하는 insulin-like growth factor 1 (IGF-1)과 fibroblast growth factor 2 (FGF-2)를 동정했다 (그림 1b) (13). 

 KRIBB의 정초록, 김장환, 손미영 공동 연구팀은 IL-2가 인간의 만능 줄기 세포로부터 장 오가노이드의 분화와 완성에 기여함을 확인했다 (14). 해당 연구팀은 장 오가노이드를 T 세포 (T cell)와 공배양 (co-culture)을 통해 오가노이드의 분화가 발생함을 확인했고, T 세포가 분비하는 사이토카인 중 IL-2가 STAT3 (signal transducer and activator of transcription factor 3)와 mTOR (mammalian target of rapamycin) 신호를 활성화시켜 장 오가노이드의 생장을 촉진할 뿐 아니라 장 세포 및 분비 세포로의 분화를 유도했다 (그림 1b).

 Ken Cadwell group과 Pawn Kumar group은 공동 연구를 통해 IL-17A가 Lgr5+ ISC를 자극해 분비 세포의 전사 조절자 (transcriptional regulator)인 ATOH1의 발현을 유도함으로써 분비 세포의 분화를 특이적으로 촉진함을 확인했다 (15). 특히 기존에 알려진 염증을 유발하는 반대되는 IL-17A의 장 상피의 정상 상태 (steady state)를 유지하는 기능은 IL-17A 항체 치료 시 장 염증 등의 부작용이 발생하는 원인을 설명했다는 점에서 의의가 있다 (그림 1b). 

 Marcel van den Brink group과 Alan Hanash group은 IL-22이 Lgr5⁺ ISC를 자극해 STAT3의 인산화 (phosphorylation)을 유도함으로써 장 오가노이드의 생장을 촉진한다는 결과를 보고 했다 (16). 반면 Scott Magness group은 IL-22가 Lgr5⁺ ISC가 아닌 TA (transient amplifying) 세포의 수를 증가함을 보고했고 (17), Hans Clevers group은 IL-22가 장 오가노이드의 생장을 저해하나 Paneth 세포의 분화를 촉진하고 PI3K-Akt-mTOR 신호전달을 통해 항균 단백질 (antimicrobial proteins)의 생성을 유도한다는 결과를 발표했다 (18). 따라서 장 오가노이드의 생장 및 분화와 관련된 IL-22의 기능은 추가 연구가 필요하다 (그림 1b). 

 앞서 살펴본 연구들을 보면, 사이토카인 및 생장 인자에 따른 장 오가노이드의 분화는 장 오가노이드에 단일 재조합 단백질을 추가함으로써 확인했다는 점에서 한계가 있다. 따라서 T 세포, 섬유아세포 (fibroblast)와 같은 다양한 종류의 기질 세포 등과 함께 배양하는 공배양 (co-culture) 연구를 통해 실제 인간의 ICS에서 장 상피가 생성되는 기전을 확인할 수 있을 것이다. 

2-3. 미생물 감염 모델 구축

 장 오가노이드는 Norovirus, Salmonella Typhi, EHEC (Enterohemorrhagic Escherichia coli)과 같은 인체 유래 감염성 장관 미생물을 연구하기 위해 활용할 수 있다 (19-21). 최근에는 Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus- 2 (SARS-CoV-2) 감염 기전을 연구하기 위해 장 오가노이드 모델이 활용되고 있다. 비록 Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) 환자는 호흡기 감염 증상이 주를 이루나 장관 감염 증상 역시 흔하게 발견되며, 특히 COVID-19에서 회복한 환자의 장 조직과 대변에서 SARS-CoV-2 항원과 바이러스 RNA가 검출되는 것으로 알려져 있다 (22). 이와 일치하게 장 세포는 SARS-CoV-2 수용체인 angiotensin I converting enzyme 2 (ACE2)와 바이러스의 감염을 촉진하는 transmembrane proteases TMPRSS2 및 TMPRSS4를 높은 수준으로 발현한다 (23). 따라서 많은 그룹들이 성체 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포에서 파생된 인간 장 오가노이드에 동일한 기전으로 SARS-CoV-2가 감염됨을 확인했으나, ACE2 발현 수준이 SARS-CoV-2 감염성에 미치는 영향은 아직 불분명하다. 

 Hans Clevers group은 최초로 장 오가노이드의 SARS-CoV-2 감염을 증명 했다 (24). 이들은 장 오가노이드의 분화를 통해 ACE2의 발현 증가를 유도했으나, ACE2 발현 증가와 관계 없이 동일한 수준의 SARS-CoV-2 감염을 확인 했다. 이와 더불어 Theodore Alexandrov, Steeve Boulant, Megan Stanifer 공동 연구팀은 SARS-CoV-2에 감염된 human organoid의 single-cell RNA-seq을 수행한 결과 ACE2 발현량과 SARS-CoV-2의 감염성과의 상관관계가 없음을 발표 했다 (25). 

 그러나 Siyuan Ding group은 장 오가노이드 SARS-CoV-2의 감염이 ACE2와 TMPRSS2의 발현 의존적임을 발표 했다 (26). 이들은 장 오가노이드의 단층 모델을 활용해 ACE2와 TMPRSS2를 높은 수준으로 발현하는 분화된 세포에서 SARS-CoV-2 감염이 발생함을 확인 했다. 또 Ken Cadwell과 Kenneth Stapleford 공동 연구팀은 25명에서 유래한 소장 및 대장 오가노이드 단층을 구축해 ACE2의 발현이 오가노이드 라인마다 다르며, SARS-CoV-2의 감염성이 ACE2의 발현에 비례함을 발표 했다 (4). 특히 장 오가노이드에서 ACE2의 발현 차이가 일차 조직 (primary tissue)에서 유래했으며, 이는 일차 조직의 고유한 특성이 장 오가노이드에 보존됨을 의미한다. Rajarajan Thandavarayan group은 human organoids의 single-cell RNA-seq을 수행해 ACE2를 발현하는 세포 (ACE2⁺) 에서 선천면역 (innate immune) 시스템이 활성화됨을 보고 했으며, 이는 ACE2⁺ 세포에서 감염에 대한 반응이 시작됨을 암시한다 (27). 

2-4. 염증성 질환 치료제의 효능 예측

그림 2. 염증성 장질환의 병인 및 이를 치료하기 위한 약물인 toficitinib의 작용 기전. a, 염증성 장질환은 유전 소인이 있는 환자에게서 장 균총과 외부 물질에 대한 과도한 면역 반응이 지속될 때 발병한다. 즉, 신체의 면역 세포가 밀집된 고유판 (lamina propria)과 장 균총 사이의 상호작용을 매개하는 장 점막 층의 붕괴가 발병의 핵심이다. 붕괴된 장 점막 층을 통해 장 균총에서 유래된 항원들이 고유판으로 유입된다. 이로 인해 활성화된 면역세포들이 염증 사이토카인들을 분비해 광범위하고 과도한 염증을 유발함으로써 장 점막 붕괴를 만성화 시킨다. b, tofacitinib과 같은 면역 저해제는 과도한 염증을 완화해 점막 회복을 유도하려는 목적으로 개발된 약물로 염증 사이토카인들이 결합해 신호를 전달하는 receptor인 JAK의 ATP 결합 부위에 경쟁적으로 결합해 JAK의 인산화를 차단한다. 최종적으로 STAT의 인산화도 차단되어 염증 신호를 유발하는 유전자들의 발현이 억제된다.

 장 오가노이드는 장에서 발병하는 염증성 질환 연구에 활용할 수 있다. 궤양성 대장염 (ulcerative colitis)과 크론병 (Crohn’s disease)으로 구분되는 염증성 장질환 (inflammatory bowel disease)은 유전 소인이 있는 사람에게서 장 균총 (microbiome)과 식품 유래 물질에 대한 과도한 면역 반응이 지속될 때 발병하는 것으로 알려져 있다 (그림 2a) (28). 유전적 및 환경적 요소들이 복합적으로 작용하는 궤양성 대장염은 과도한 염증으로 인해 신체의 면역 세포가 밀집된 고유판 (lamina propria)과 장 균총의 상호작용을 매개하는 장 점막 (intestinal epithelium) 층의 붕괴가 발병의 핵심이다 (그림 2a). 따라서 tofacitinib과 같은 면역 저해제 (immunosuppressant)는 과도한 염증을 완화해 점막 회복을 유도한다. Tofacitinib은 염증 사이토카인들이 결합해 신호를 전달하는 receptor인 Janus kinase (JAK)의 인산화를 차단하며, 최종적으로 STAT의 인산화도 차단되어 염증 신호를 유발하는 유전자들의 발현이 억제된다 (그림 2b) (29). 그러나 tofacitinib의 명확한 기전과는 달리 복용한 환자의 30%가 최초 투여에 반응하지 않는다 (30). 따라서 조직 확보 당시의 유전적 및 후생유전적 (epigenetic) 변이들을 보존하고 있는 장 오가노이드는 일차 무반응의 원인을 규명하고 환자의 반응성을 예측하는 연구에 활용될 수 있다. 

그림 3. Tofacitinib 약물 반응성 실험의 방법론. 성공적으로 생성 및 배양된 장 오가노이드에 다양한 염증 사이토카인들을 처리하면 장 오가노이드의 사멸이 유도될 것이다. 만일 Tofacitinib과 염증 사이토카인들을 동시에 처리했을 때 tofacitinib에 반응하지 않는 환자 유래 장 오가노이드만 사멸한다면, 해당 약물의 반응성을 확인할 수 있다.

 예를 들어 tofacitinib에 대한 장 오가노이드의 반응 유무가 유래한 궤양성 대장염 환자의 반응성에 따라 다르다면 환자의 tofacitinib 반응성을 치료 전에 확인할 수 있을 것이다 (그림 3). 더 나아가 장 오가노이드-T 세포 공배양 모델을 통해 장 점막에 대한 tofacitinib 반응성과 민감도에 차이가 발생하는 기전을 분자 수준에서 분석해 해당 약물에 반응을 보이는 환자와 그렇지 못한 환자를 구분하는 특성들을 동정할 수 있다. 최종적으로 기존 면역 억제제가 갖는 단점의 원인을 분석함으로써 새로운 신약 개발의 단서를 제공 할 수 있을 것이다. 

3. 결론

 인간의 장 기능, 분자 및 세포 이질성을 보존하고 있는 장 오가노이드는 장관 세포의 분화 기전, 장내 병원균 감염 기전, 장 염증 질환의 치료제 개발 및 반응성 예측 등 다양한 연구에 기여하고 있으며, 공배양 기술 및 오가노이드 배양 기술의 발전으로 인해 향후 더 많은 분야에 활발하게 사용될 것이다. 

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