생화학분자생물학회

고형종양 면역치료의 혁명: CAR-M 세포치료제 

(Revolution in Solid Tumor Immunotherapy: CAR-M Cell Therapy) 

박광열: 한양대학교 공과대학 생명공학과 (gkgk0221@hanyang.ac.kr​)​

박희호: 한양대학교 공과대학 생명공학과 (parkhh@hanyang.ac.kr)​

1. 서론

최근, 생명공학 기술의 눈부신 발전으로 불치병으로만 여겨지던 고형종양을 치료하기 위해 새로운 면역치료 기술들이 개발되고 있다. 니볼루맙(Nivolumab, 제품명: OPDIVO^®), 펨브롤리주맙(Pembroblizumab, 제품명: KEYTRUDA^®)으로 대표되는 면역관문 억제제(Immune Checkpoint Inhibitor)의 개발은 체내 면역계를 이용한 면역항암제의 새로운 패러다임을 제시하였다(1). 이후, 면역세포에 유전공학기술을 도입하여 CAR-T, CAR-NK 등 면역세포치료제(Immune Cell Therapy)의 개발이 진행되고 있다.​

특히, CAR-T, CAR-NK등의 면역세포치료제는 첨단 유전자 기반 세포치료제로서, 특정 항원(Antigen)을 특이적으로 인식하는 키메라 항원 수용체(CAR, Chimeric Antigen Receptor)를 면역세포에 인위적으로 발현시켜, 암세포 특이적인 체내 면역반응을 촉진하고 면역체계의 기억작용을 이용하여 암의 재발을 방지 할 것으로 기대되었다. 그러나, CAR-T 세포치료제는 실제 임상에서 B Cell Lymphoma, Leukemia 등의 혈액암(Hematologic Maligancy)에 대해서는 탁월한 효과를 보이며, 2022년 5월 미국 FDA에서 최종승인 되었지만(KYMRIAH, Novartis), 고형종양에서의 효과는 미미하였다.

고형종양은 종양미세환경(Tumor-Microenvironment, TME) 형성을 통하여, 종양 주변 면역세포의 탈진​(Exaustion)을 유도하고 종양세포의 성장 및 전이를 촉진한다. 또한, T세포는 비가역성 세포로, 비활성시 영구적 기능 상실을 일으키기 때문에 고형종양 치료에 대한 새로운 대안이 필요하게 되었다. 

대식세포(Macrophage)는 체내 면역반응을 시작하는 선천 면역세포(Innate Immune Cell)의 한 종류로서, T세포와 다른 양상의 Cytokine Release Profile 및 종양 침습(Tumor Infiltration)적 특성으로 인해 부작용을 거의 일으키지 않고, 고형종양 내로 쉽게 침투할 수 있다. 특히, 대식세포는 고형종양 주위의 TME 형성과 암세포 증식을 촉진하는 TAMs(Tumor-Associated Macrophages)의 형태로 많이 존재하는데, 이는 복잡한 체외 생산 방식(Ex Vivo Generation)이 아닌, 대식세포를 표적으로 하여 체내 TAMs에 CAR 유전자를 전달하는 체내 프로그래밍 방식(In Vivo Programming)을 가능하게 하며, 복잡한 공정 방식을 획기적으로 줄일 수 있다.

위와 같은 특성들로 최근, CAR-M(CAR-Macrophage)은 고형종양 치료에 유망한 차세대 면역세포치료제로서 주목받고 있으며, 국내외로 활발한 연구가 진행되고 있다. 본 보고서에서는 CAR-M의 고형종양 치료에 대한 여러 최신 연구 동향 및 실제 임상 적용 사례에 대해 소개하고자 한다.

그림 1. 복잡한 CAR-T 체외 생산 공정

2. 본론

2-1. Chimeric Antigen Receptor(CAR)의 구조

CAR는 특정 단백질이나 항원과 결합하도록 디자인된 모든 융합 단백질 수용체(Fusion Protein Receptor)를 총칭하나, 일반적으로는 면역 효능 세포(Immune effector cell)에 발현시켜, 표적 항원 특이적인 면역 활성을 유도하는 융합 단백질 수용체를 뜻한다. CAR의 구조는 항체에서 유래하여 특정 항원에 결합하는 scFv(Single-Chain Variable Fragment) 영역과 항원 결합 부위와 막 통과 영역 사이의 유연성을 결정하는 힌지 영역(Hinge Domain), CAR를 고정하는 막 통과 영역(Transmembrane Domain), T세포의 생존과 증식에 관여하는 공동 자극 영역(Co-Stimulatory Domain), 면역세포 활성을 유도하는 활성화 영역(Activation Domain)으로 구성된다. CAR는 전반적으로 TCR(T Cell Receptor)과 구조가 유사하나, MHC(Major Histocompatibility Complex) / HLA(Human Leukocyte Antigen)에 의한 자기-비자기 판별(Self-Nonself Discrimination) 없이, 항원 결합만으로 T세포를 활성화 한다는 장점이 있다.

그림 2. Chimeric Antigen Receptor(CAR)의 구조

2-2. Chimeric Antigen Receptor(CAR)-T의 세대와 한계점

CAR의 구조는 CAR-T 연구에 적용된 순서를 따라 1~ 4세대로 분류된다. 1세대 이전, CAR는 TCR의 Modification된 형태로 항체와 TCR이 결합된 형태로 설계되었다(2). 그러나, TCR의 항원 결합 부위 형성을 위해선 두 개의 Chain이 Dimer 형태를 이뤄야 했고, MHC의 결합을 통한 자기 판별(Self-Discrimination)이 필요하였기 때문에, 하나의 Chain으로 이루어진 항체의 항원 결합 부위인 scFv와 CD3ζ등 면역세포 수용체의 신호 전달 부위(Leukocyte Intracellular Signaling Domain)가 결합된 1세대 CAR가 탄생하였다(3). 그러나 기대와 달리, 1세대 CAR는 In Vitro와 전임상 단계에서 고무적인 결과를 보였으나, 실제 임상에서 난소암 환자에 투여 후, 항암효과가 거의 나타나지 않았으며, 투여된 CAR-T 세포는 1달 내로 모두 사멸하여 Persistency면에서 단점을 보였다(4).

그림 3. Chimeric Antigen Receptor(CAR)의 세대별 구조

이후, T세포의 면역기능 활성에 CD28 등 공동-자극 수용체 신호(Co-Stimulatory Receptor Signal)가 필요하다는 것이 밝혀지면서(5), CD28 신호 전달 부위가 결합된 2세대 형태의 CAR가 등장하였다. 2세대 CAR-T는 1세대에 비해, In Vitro와 전임상 단계에서 향상된 증식 속도와 지속성, IL-2 등 면역 사이토카인의 생성증가를 보였고, 만성 림프구 백혈병(Chronic Lymphocytic Leukemia)에 대한 첫 임상에서 10년간 만성 림프구 백혈병을 앓던 환자의 완치에 성공하면서, 항암 치료에 대한 새로운 패러다임을 제시하였다(6).

2세대 CAR-T의 임상 성공으로, 공동 자극 영역(Co-Stimulatory Domain)의 존재가 CAR-T의 효능에 영향을 미친다는 사실이 밝혀지며, 공동 자극 영역을 하나 더 추가한 3세대 CAR-T가 개발되었다. 3세대 CAR-T는 전임상 단계에서 2세대 CAR-T에 비해 40배 이상의 증식 속도를 보이며, mice 체내에서 3달 이상 지속된다는 것을 밝혔다(7). 그리고, 만성 림프구 백혈병에 대한 임상 적용 결과, 상대적으로 적은 양의 투여(10⁶ cells/m² or 5x10⁶ cells/m²)만으로 8명 중 6명의 환자에서 유의미한 치료 경과를 보였고, 3달 이상 체내에서 유지됨을 확인하였다(8). 3세대 CAR-T의 경우, 아직 그 효능을 확인하기에 충분한 임상데이터가 확보되지 않아, 그 귀추가 주목된다.

혈액암에 대한 1~3세대 CAR-T의 성공은 CAR-T의 항암제로서의 가능성을 제시하였다. 그러나, 혈액암은 전체 암 발병 중 9%만을 차지하며, 그 외의 경우 대부분 고형종양으로 알려져 있다. 고형종양은 혈액암과 달리, 면역 억제적인 TME를 형성하여 CAR-T의 면역기능을 영구 상실시키는 탈진(Exhaustion)을 일으키기 때문에, CAR-T의 고형종양 적용을 위해 새로운 전략이 필요하게 되었다. 이어, 개발된 4세대 CAR-T는 2세대 CAR와 IL-12, IFN-g 등 면역 사이토카인을 함께 분비하여, TME 형성에 관여하는 항염증성 면역세포(Anti-inflammatory Immune Cell)를 다시 면역 활성을 갖는 염증성 면역세포(Inflammatory Immune Cell)로 재 분극화(Re-Polarization)하고, TME 개선과 고형종양 주변 면역세포를 이용하고자 하였다. 현재, 간세포암(NCT03980288), 골육종(NCT03356782), 다발성 골수종(NCT03271632) 등 다양한 고형종양에 대한 임상이 진행되고 있으며 그 경과를 지켜볼 필요가 있다.

2-3. Macrophage의 특성

대식세포(Macrophage)는 선천 면역체계(Innate Immune System)의 핵심 세포로, 체내로 침입한 병원체를 죽이는 효능 세포(Effector Cell)로서의 기능과 체내 적응 면역체계(Adaptive Immune System)의 활성을 유도하는 항원 제시 세포(Antigen-Presenting Cell)로서의 기능을 동시에 수행한다. 또한, 뛰어난 가소성(Plasticity)을 바탕으로 조직 내로 침투하여, 침입한 병원체(Pathogen), 세균(Bacteria) 또는 세포 잔해(Cell Debris), 암세포(Tumor Cell) 등을 비특이적으로 포식(Phagocytosis) 한다. 포식 된 병원체는 항원(Antigen)으로 분해 및 주조직적합성 복합체(MHC I, Major Histocompatibility Complex I)를 통해 제시되어, 해당 항원에 특이적인 적응 면역체계(Adaptive Immune System)를 활성화할 수 있다.

특히, 대식세포의 조직 침습(Tissue Infiltration)적 특성이 크게 주목받고 있는데, T세포는 다른 면역세포에 비해 우월한 면역체계 활성 능력으로 초기 연구에서 주목받았지만, 실제 임상 결과 고형종양 주변 TME에 의해 쉽게 제어되고, 고형종양 내부로 침투가 어렵다는 문제점이 발견되었다. 반면, 대식세포는 특유의 침습성으로 고형종양에 쉽게 침투할 수 있으며, 실제로 대부분의 고형종양에서 내부로 유입되는 세포 중 50% 이상이 대식세포로 밝혀졌다(9). TME 환경에 노출된 대식세포는 T세포와 마찬가지로 면역기능을 잃고, 항암 면역 작용을 억제하지만, 영구적으로 기능을 상실하는 T세포와 달리, 대식세포는 외부 자극에 의해 다시 표현형 변화(Phenotype Shift)가 유도될 수 있다는 장점이 있다. 즉, CAR-M이 고형종양 내로 침투하여, TME에 노출되어도 CAR에 의해 항원을 인지하면 다시 면역 활성을 나타낼 수 있기 때문에, CAR-T나 다른 면역세포치료제에 비해 상당한 이점이 있다. 이와 같은 장점들로, CAR-M은 여타 치료제에 비해 고형종양 면역치료의 혁명으로서 주목받고 있다.

그림 4. 대식세포의 고형종양 유입과 재 분극화(Re-Polarization)

2-4. CAR-Macrophage

가장 먼저, CAR-Macrophage의 임상에 돌입한 사례는 CARISMA Therapeutics(Philadelphia, PA, USA)의 CT-0508이다. CT-0508은 재조합 아데노 바이러스 플라스미드 벡터(Ad5/F35)를 이용하여, 80% 이상의 높은 형질도입(Transduction) 효율로, 식도암, 난소암, 유방암 등 다양한 고형종양에서 발현되는 HER2를 표적으로 하는 Anti-HER2 CAR-M의 체외 생산 방식 플랫폼을 구축하였으며, 고형종양 치료에 대한 가능성을 인정받아 2021년 9월 FDA의 Fast Track Designation으로 선정되며, 빠르게 임상에 돌입하였다.

2022년 7월 발표된 CT-0508의 임상 1상 중간 결과(NCT04660929)는 매우 고무적이다. CAR-M을 투여한 환자는 7명으로, 모두 전이성 고형종양 환자이며, 유방암(2명), 식도암(2명), 담관암(1명), 난소암(1명), 침샘암(1명)으로 다양한 고형종양 환자에 투여하였다. 환자를 두 그룹으로 나누어, Group 1(5명)에 2회 투여(Day 1, 3), Group 2(2명)에 3회 투여(Day 1, 3, 5)하였으며, 1회 투여량(Dose)은 5 x 10⁸ CAR-M씩 투여하였다(10).

첫 투여 이틀간, 모든 환자군에서 미미한 CRS(Cytokine Release Syndrome​), 모든 환자에서 고열, 저혈압이 관찰되었으나, 48시간 내로 정상 범주에 진입하였고, 그 외의 경우, 경미한 빈혈, 림프구 감소 등의 부작용을 보였으나, 투약 중지로 이어질 정도의 심각한 부작용은 발생하지 않았다. 특히, ICANS(Immune effector Cell-Associated Neurotoxicity Syndrome​)와 특정 장기 손상 등의 부작용은 관찰되지 않았고, CRS의 원인인 IL-6와 다른 면역 사이토카인(IL-8, IL1β, TNFα, IFNγ)은 일시적으로 증가하였으나, 일정 수준 유지되며, CRS를 유발할 정도의 과도한 분비는 일어나지 않았다(10).

결과적으로, CAR-M 투여 후, 생명에 직결될 정도의 심각한 부작용은 나타나지 않았고, 모든 환자군에서 투여 4-8시간 내에 CAR-M이 고형종양내로 침투하였고, TME를 개선하여 TME내 면역 활성 세포(CD8+ T cell, Macrophages, Neutrophils)의 수가 증가하였고(Day 8), TME와 혈액 내에 존재하는 고형종양 특이적 CD8+ T cell의 증식이 관찰되었으며(Day 15), 4주 이상 유지되었다. 공개된 결과에서는 직접적인 고형종양의 감소와 경과에 대해 언급은 없었으나, TME 개선과 CAR-M의 고형종양 침투, 항암 특이적 면역체계의 활성을 보여주는 지표는 매우 긍적적으로 보이며, 심각한 부작용을 보이지 않았다는 점은 주목할 만 하다(10).

2-5. In vivo programming

 TAMs(Tumor-Associated Macrophages)는 대식세포의 표현형 중 M2의 한 종류로 여겨진다. M2는 만노오스 수용체(Mannose Receptor, CD206)를 과발현하며, 이는 TAMs도 마찬가지이다(11). 최근, TAMs가 고형종양 치료에 중요한 표적세포로 주목받으며, 표적 약물에 만노오스를 결합하여, TAMs에 표적 전달하고자 하는 연구가 많이 진행되고 있으며, TAMs에 면역활성 유전자(mRNA, Plasmid DNA)를 만노오스-나노캐리어로 표적 전달하고자 하는 체내 프로그래밍 연구 또한 활발히 진행되고 있다(12). 

본 집필 연구진에서도 만노오스-PEI(MPEI)를 이용하여, 신경모세포종(Neuroblastoma)을 이식한 mice의 종양 주변 TAMs에 CAR와 IFN-γ 유전자를 비-바이러스성 PiggyBac Transposon Vector를 활용해, TAMs 유전체(Genome)내로 효과적으로 전달하였다. 유전자가 삽입된 CAR-M은 Mice 체내에서 3주 이상 오래 지속 되었으며, TME를 개선하였고, 고형종양 내로 침투하는 CD8+ T cell 수를 증가시켰으며, 16일 내로 이식된 신경모세포종은 대부분 사멸하였다(13). 해당 연구를 통해, TAMs에 CAR 유전자를 표적 전달이 가능하며, TME 개선과 CAR-M을 고형종양 주변에 생성하여, 치료 효과를 극대화할 수 있음을 검증하였다.

그림 5. Mannose-PEI를 이용한 TAMs 표적 CAR-M 체내 프로그래밍

 Macrophage의 조직침습적 특성과 더불어, 종양주위에 풍부히 존재한다는 점으로 인해 CAR-Macrophage의 In Vivo Programming 연구도 활발히 진행되고 있다. 체내 프로그래밍 방식은 가장 최근 기대를 모으고 있는 면역세포치료제 생산 방식으로, 현재 T Cell Lymphoma에 과발현된 CD5를 표적으로 하는 최초의 CAR-M In Vivo Programming 파이프라인(MT-101)이 임상 진행 중 이다(NCT05138458). 체내 프로그래밍 방식은 실제 상용화되었을 때, 단축된 치료 과정 및 정해진 제형의 제품(Off-the-Shelf)을 만들 수 있어 비용적 측면에서 굉장히 매력적인 방식이다. 특히, COVID-19에 대한 mRNA 백신에 LNP(Lipid Nanoparticle)가 사용되며, 유전자 치료제와 체내 유전자 전달 방식에 대한 관심이 어느 때보다 뜨거워진 상황에서 그 결과가 주목된다.

MT-101은 Myeloid Therapeutics(Cambridge, MA, USA)에서 개발된 LNP 기반의 유전자 치료제로, Anti-CD5 scFv와 CD89가 결합된 CAR mRNA를 체내 골수성 세포(Monocyte, Macrophage, Dendritic cell 등)로 전달하여 CAR 유전자를 발현하는 방식의 유전자 치료제이다. 2022년 10월 FDA Fast Track Designation 되며, 임상에 적용된 최초의 CAR-M 체내 프로그래밍 치료제가 되었다. CAR mRNA는 체내 골수성 세포(Monocyte, Macrophage, Dendritic cell 등)에 전달되어 세포 표면에 발현된 Fc-gamma 수용체에 결합하고, CAR의 최종 구조를 이룬다. 아직, 1상 데이터는 공개되지 않았으나, 투여 증량에 따른 독성은 발견되지 않았으며, CRS, ICANS 등의 부작용도 나타나지 않은 것으로 보고되었다(14).

그림 6. CAR-Macrophage 임상현황

3. 결론

 CAR-M을 이용한 앞선 임상 결과는 CAR-T와 비교하여, CAR-M의 고형종양 치료 가능성을 시사한다. CAR-M은 투여 후 빠르게 TME 내로 침투하였고, 종양-면역 환경(Tumor Immune Landscape)의 리모델링(Remodeling) 및 개선하였으며, 체내 적응면역체계를 활성화 하였다. 또한, CRS, ICANS 등의 부작용은 거의 나타나지 않았다. 비록, CAR-M의 임상 적용 사례는 충분히 검증될 만큼 진행되지 않았으나, 지금까지의 결과는 매우 긍정적이며 PD1 Inhibitor의 병용투여 등 사용 가능한 여러 전략의 임상이 예정되어 있어 그 결과가 기대된다.

반면, 긍정적인 결과와 별개로 해결해야 할 문제도 있다. CAR-M은 체내에서 지속성(Persistence)이 CAR-T 보다 낮아서(최소 62일), 상대적으로 더 많은 양을 투여한다(15). CT-0508의 경우, 환자당 1.42 x 109(중앙값, Median)의 CAR-M을 투여함으로, 이는 상용화를 막는 요인이 될 수 있다. 또한, CAR-M의 In Vivo 생체 분포(Biodistribution) 결과 및 전임상 결과에서, 체외에서 주입된 CAR-M은 간과 폐에 많이 축적되는 경향을 보였으며, 지속 투여시 원치 않는 부작용을 일으킬 수 있기 때문에 추가적인 검증이 필요해 보인다.

결과적으로, CAR-M은 아직 연구의 초기 단계지만 진행 중인 두 임상은 긍정적인 가능성을 제시하였고, 여러 해결해야 할 문제점 또한 제시하였다. 하지만, CAR-M이 고형종양에 적용된 면역세포치료제 중 성공적인 첫 사례임은 분명하며, 체내 프로그래밍 방식 등 다양한 전략을 통해 값비싼 치료비용을 극적으로 낮출 수 있는 고형종양 면역치료의 혁명은 명확해 보인다.

4. 참고문헌

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2. Y Kuwana, Y Asakura et al(1987) Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V regions and T-cell receptor-derived regions. Biochem Biophys Res Commun 149:960–8

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5. DJ Lenschow, TL Walunas, JA Bluestone(1996) CD28/B7 system of T cell co-stimulation. Annu Rev Immunol 14:233–58.

6. DL Porter, BL Levine, M Kalos, A Bagg, CH June(2011) Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med 365:725–33.

7. CA Ramos, R Rouce et al(2018) In vivo fate and activity of second- versus third-generation CD19-specific CAR-T cells in B cell non-hodgkin’s lymphomas. Mol Ther 26(12):2727–37.

8. ML Schubert, A Schmitt et al(2021) Third-Generation Chimeric Antigen Receptor(CAR) T Cells in Patients with Relapsed/Refractory Acute Lymphoblastic Leukemia(ALL) and Non-Hodgkin Lymphoma(NHL) - Results from the Heidelberg Trial 1(HD-CAR-1 trial). Blood 138:1734.

9. CA Ramos, R Rouce et al(2018) In vivo fate and activity of second- versus third-generation CD19-specific CAR-T cells in b cell non-hodgkin’s lymphomas. Mol Ther 26(12):2727–37.

10. Reiss K, Yuan Y et al(2022) 634 phase 1, first-in-human(FIH) clinical trial of the anti-HER2 CAR macrophage CT-0508 in participants with HER2 overexpressing solid tumors. Journal for ImmunoTherapy of Cancer/jitc-2022-SITC2022.0634

11. RA Flavell, S Sanjabi, SH Wrzesinski, PL Limon(2010) The polarization of immune cells in the tumour environment by TGF-β. Nat. Rev. Immunol 10, 554.

12. F. Zhang, N. N. Parayath et al(2019) Genetic programming of macrophages to perform anti-tumor functions using targeted mRNA nanocarriers. Nat commun 10:3974

13. M. Kang, S.H. Lee et al(2021) Nanocomplex-mediated in vivo programming to chimeric antigen receptor-M1 macrophages for cancer therapy. Adv. Mater. 2103258

14. L. Chocarro, E. Blanco et al(2022) Cutting-Edge CAR Engineering: Beyond T Cells. Biomedicines 10(12), 3035

15. Klichinsky M, Ruella M et al(2020) Human chimeric antigen receptor macrophages for cancer immunotherapy. Nat Biotechnol 38(8), 947-953